摘要
【背景及目的】 白藜芦醇（Resveratrol,RSV）是一种广泛存在于虎杖、葡萄、浆果和花生等植物块根中的天然多酚类植物抗毒素，具有抗炎症、抗氧化、抗衰老和抗肿瘤等作用。流行病学研究发现适量食用红酒可以降低心血管疾病的发病率，是因为葡萄酒中含有白藜芦醇，研究表明白藜芦醇能抑制炎症、保护血管内皮细胞、降脂及抗脂质氧化等，这些都与心血管疾病的低发生率密切相关。自噬被认为是一种细胞的自我保护作用，它可以为机体提供能量，维持细胞内稳态，促进异常细胞的凋亡，自噬与肿瘤、心血管疾病、神经退化疾病和感染等密切相关。心肌细胞是永久细胞即无再生能力，因此自噬作为一种细胞自我保护机制对于心肌细胞来说更为重要。近年来，白藜芦醇受到越来越多人的关注，已有研究发现白藜芦醇对肝细胞、癌细胞和单核细胞的自噬均有影响，那么白藜芦醇是否影响心肌细胞的自噬，了解其机制，对预防及治疗心血管疾病具有重要意义。 目的： 1.研究RSV对心肌H9C2细胞自噬的影响。 2.研究RSV诱导心肌H9C2细胞自噬的分子机制。 【材料和方法】 用含10%澳洲胎牛血清的DMEM培养基体外培养H9C2细胞，待细胞生长至70%到80%融合且生长状态良好、处于对数生长期时进行加药物处理，用含不同浓度的白藜芦醇（0μM、25μM、50μM、100μM、200μM、300μM）的培养基处理H9C2细胞24 h；含20μM白藜芦醇的培养基处理H9C2细胞不同时间(0 h、6 h、12 h、24 h)；用AMPK抑制剂10μM（Commpound C）与DMEM培养基混合均匀，处理细胞24 h。使用倒置相差显微镜观察H9C2细胞的形态学变化；MTT检测细胞的活性；蛋白免疫印迹检测自噬相关蛋白的表达。应用SPSS19.0处理实验结果，且采用统计分析软件中的单因素方差分析（one-way ANOVA）。 【结果】 1、细胞形态学观察表明，不同浓度RSV处理H9C2细胞24 h，0μM、25μM、50μM、100μM组的细胞数量及形态未见明显变化，而200μM、300μM组部分细胞的形态由梭形开始变圆，间隙增大，部分细胞出现死亡。用含20μM白藜芦醇的培养基培养H9C2细胞不同时间(0 h、6 h、12 h、24 h)，细胞的形态未发生明显变化。用不同浓度AMPK抑制剂Compound C处理的H9C2细胞，Compound C 10μM组与正常组及白藜芦醇处理组相比部分细胞形态发生变化，细胞变圆，少量死亡，而Compound C 20μM组与正常组及白藜芦醇处理组相比细胞的形态发生明显变化，细胞变圆且几乎全部死亡。 2、MTT存活率测定表明，不同剂量的白藜芦醇处理H9C2细胞，当RSV浓度在100μM以下，细胞存活率有轻度下降趋势；而当RSV超过100μM，直到300μM时，细胞存活率呈明显下降趋势，且与空白对照组比较差异具有统计学意义。 3、Western blot结果显示，与对照组相比25、50和100μM的白藜芦醇能明显诱导细胞发生自噬，自噬相关蛋白如Beclin1、Atg5和LC3Ⅱ的表达水平呈上升趋势，而自噬负相关因子mTOR和p-p70s6k的表达水平呈下降趋势，此外p-AMPK和sirt1也呈高表达趋势，所有检测的自噬相关蛋白均呈剂量依赖性。用20μM白藜芦醇处理不同时间（0-24h）能够显著地促进H9C2细胞的自噬，除Sirt1蛋白水平无明显变化外，其他与自噬正相关的蛋白水平呈上升趋势，与自噬负相关的蛋白水平呈下降趋势。 4、加入AMPK抑制剂Compound C之后，与自噬相关蛋白的表达水平趋势发生了反转，自噬负相关蛋白p-p70s6k表达水平明显上升，而自噬正相关蛋白p-AMPK、Beclin1和LC3Ⅱ表达水平明显下降。 【结论】 1、白藜芦醇在100μM浓度范围内能显著地诱导心肌H9C2细胞自噬，可能对心肌有一定保护作用。 2、白藜芦醇诱导H9C2细胞自噬的机制与AMPK-mTOR通路有关。
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