摘要
水牛是世界上第二大泌乳家畜，水牛奶营养价值高，但水牛泌乳量低，世界尚无专门化乳用水牛品种，严重制约了水牛产业的发展。分子标记辅助选择法（Marker Assisted Selection，MAS）是提高奶牛泌乳性能的有效途径，但水牛泌乳性状的分子标记相对较少，此外，功能基因及其突变对水牛泌乳性能的调控作用及机制研究也相对薄弱。本实验室前期水牛乳腺组织转录组测序结果表明， ACAA1 (acetyl-Coenzyme A acyltransferase 1，乙酰辅酶A酰基转移酶1) 在泌乳期水牛乳腺组织中高表达，提示ACAA1可能调控水牛乳腺组织细胞功能，进而影响水牛泌乳性能，但其对牛（奶牛/水牛）泌乳性状调控作用及机制研究尚未见报道。因此，本研究目的在于：①以地中海水牛为研究对象，筛选ACAA1基因与泌乳性状相关的分子标记，为水牛泌乳性状分子标记辅助选择提供技术支撑；②以水牛乳腺上皮细胞为模型，阐明ACAA1基因对乳腺上皮细胞生长和分泌功能的影响，为阐明水牛泌乳性状的调控机制奠定基础。主要研究结果如下： （1）ACAA1 在水牛组织中的表达与定位规律：ACAA1 在水牛乳腺和卵巢组织中相对表达量较高，而在胃、心脏等器官中相对表达量较低；ACAA1在泌乳中后期的水牛乳腺组织中表达量显著高于泌乳前期（p<0.05），主要定位于水牛乳腺上皮细胞，在细胞质和细胞核内均有分布； （2）ACAA1 基因多态性筛选及与地中海水牛泌乳性能关联分析：在地中海水牛群体中筛选到ACAA1基因的5个SNP位点，分别位于启动子（g.-681A>T）、内含子（g.-1868C>T、g.-23117C>T、g.-24348G>T）和3′UTR（g.-806C>T）区域；基因分型数据结果表明，g.-681A>T、g.-1868C>T、g.-24348G>T和g.-806C>T等4个SNP位点属于中度多态（PIC>0.25），g.-23117C>T位点属于低度多态（PIC=0.21）。 将5个SNP位点不同基因型与384头地中海水牛泌乳性状（270d泌乳量、高峰奶量、乳脂率、乳脂量、乳蛋白率、乳蛋白量）进行关联分析，结果显示，5个SNP位点均与乳脂率、270d乳脂量、乳蛋白率及270d乳蛋白量显著关联（p<0.05），其中g.-1868C>T、g.-23117C>T及g.-24348G>T与270d泌乳量显著相关（p<0.05）， g.-1868C>T与高峰奶量显著相关（p<0.05）；此外，寻找到一个单倍型block（包含g.-1868C>T、g.-23117C>T及g.-24348G>T），发现优势单倍型组合H1H1各项泌乳 指标（270d泌乳量、乳脂率、270d乳脂量、乳蛋白率及270d乳蛋白量）均显著高于其他单倍型个体（p<0.05）。 （3）ACAA1突变影响启动子活性：以上筛选到的SNPs均位于非编码区，推测影响了ACAA1基因的转录调控；因此，利用双荧光素酶报告系统分析位于启动子区域g.-681A>T位点对ACAA1基因转录活性的影响，结果表明，野生型（A）荧光素酶活性约为突变（T）型的6倍，说明启动子区A等位基因可正向调节ACAA1启动子的转录活性。 （4）ACAA1敲低抑制水牛乳腺上皮细胞增殖与分泌功能：ACAA1 RNAi结果表明，敲低ACAA1后，水牛乳腺上皮细胞数量下降约35%，活力下降约50%，S期细胞比例显著降低（p<0.05）。细胞周期相关蛋白Cyclin D1、增殖相关蛋白PCNA、凋亡抑制蛋白 Caspase3 表达量显著下调（p<0.05）；敲低 ACAA1 后，细胞脂滴分泌水平显著降低（p<0.05），细胞 β-酪蛋白分泌水平显著降低（p<0.05）；乳脂代谢通路相关基因（SREBP1、ACC、FABP3、PPARγ、FAS）和乳蛋白代谢通路相关基因（JAK2、4EBP1、RPS6KB1）mRNA的相对表达量显著降低 (p<0.05)。 本研究在ACAA1基因非编码区筛选到5个SNP位点及1个单倍型与地中海水牛高峰奶量、270d泌乳量、乳脂率、270d乳脂量、乳蛋白率及270d乳蛋白量等泌乳性状显著相关；而启动子区域（g.-681A>T）突变，影响了ACAA1启动子转录活性，可能与基因表达调控有关；功能研究证实，敲低ACAA1抑制水牛乳腺上皮细胞增殖、脂滴和β-酪蛋白分泌水平，下调乳脂、乳蛋白代谢通路基因表达。而ACAA1基因及其突变通过影响乳腺上皮细胞增殖、乳脂分泌及乳蛋白表达，进而影响了水牛泌乳性能。本研究结果为水牛泌乳性状标记辅助选择提供了技术支撑，为阐明水牛乳腺发育及泌乳调节机制提供了参考。
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