摘要
目的： 筛选抗诺卡氏菌有效复方（中药复方DS），制备中药复方DS最佳提取物，为中药复方提取物抗诺卡氏菌研制提供参考。 方法： ①测定诺卡氏菌数目与吸光度关系，建立菌悬液中诺卡氏菌计数方法。利用微量肉汤稀释法，以恩诺沙星对诺卡氏菌的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度为指标，建立体外抑菌效果评价方法，筛选出抗诺卡氏菌效果最佳的中药复方DS。 ②采用紫外-可见分光光度法建立中药复方DS提取物化学评价方法，考察中药复方DS提取方法、溶媒、粉碎度、溶媒用量、提取时间以及提取次数；使用L9（34）正交设计试验，选取粉碎度、溶媒用量、提取时间和提取次数因素，优选出中药复方DS最佳提取工艺。 ③以石油醚—乙酸乙酯（8∶2）为展开剂，应用薄层色谱法对中药复方DS最佳提取物进行定性鉴别。选用流动相：甲醇—水（80∶20），色谱柱：Eclipse XDB—C18柱（4.6mm×150mm，5μm），柱温：25℃，检测波长：270nm，检测器：DAD，分析时间：30min，流速：1.0ml/min，使用高效液相色谱法测定中药复方DS最佳提取物中指标成分C含量。 ④进行中药复方DS提取物安全性实验。比较了腹腔注射、创伤浸泡、非创伤浸泡、喂食等不同的感染方法，以感染率、死亡率、病原菌的检查等为评价指标，建立诺卡氏菌乌鳢感染模型。以建立的诺卡氏菌感染乌鳢模型为基础，以症状表现、病原检查、死亡率、存活质量为指标，综合评价不同给药量对该动物的治疗效果。 ⑤分别设试验组与对照组，对比三种代表性免疫指标：溶菌酶、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶在12d内的变化规律。 结果： 筛选出中药复方DS抗诺卡氏菌的效果最佳。中药复方DS提取物的紫外最大吸收波长为270nm，线性、重现性、稳定性、加样回收率等方法学考察均小于2%。中药复方DS最佳提取物的制备工艺为：粉碎过60目筛网，选用溶媒Ⅴ，回流提取3次，每次45min，提取溶媒用量为8倍。中药复方DS提取物薄层鉴定样品、对照品的指示斑点一致，展开清晰，Rf值适中。以2×108cfu/ml的诺卡氏菌液，通过腹腔注射感染建立的乌鳢感染模型症状明显，死亡率为10%，感染率为100%，重复性好。中药复方DS最佳提取物治疗乌鳢诺卡氏菌病方案为连续2d取20%投料量饲料，加入20%投料量30%的中药复方DS最佳提取物混合均匀投喂，其治愈率达100%，观察12d期间实验动物无异常情况。中药复方DS最佳提取物有提高溶菌酶、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶活性的作用，具有提高乌鳢免疫力的效果。 结论： 中药复方DS提取物抗诺卡氏菌效果较好，为开发中药新药抗诺卡氏菌提供了依据。
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