摘要
选题依据： 中药质量对中医药临床用药的安全有效至关重要，而化学成分是中药发挥药效的物质基础，决定着中药的质量，易受多种因素影响，一直是药用植物资源研究的热点。临床功效是药材的根本属性，药效是药材质量评价的“金指标”，中药材的药效是通过复方表现的。因而构建基于药效的质量评价方法对准确评价和发展黄芪资源尤为重要。黄芪是中医常用药材，而现行黄芪质量评价方法：指标成分含测，难以表征中药多成分整体化学特征；HPLC指纹图谱与指标成分含测相比，表征的化学成分相对较多，主要用于反映中药的一致性，难以体现其差异性，但因受依托技术的限制，表征仍具有选择性，不够全面；且二者表征的化学成分信息难以与中药药效进行科学关联。本研究首先拟采用无偏向性具有整体观的核磁代谢组学技术对不同来源的黄芪药材进行系统的化学质量评价；选择化学差异较大的山西黄芪和甘肃黄芪构建基于体外化学和体内代谢变异关联分析的黄芪均一性和差异性评价方法。其次将黄芪配伍到防己黄芪汤经方中，以干预阿霉素肾病肾保护作用为评价指标，进行药效学研究，构建基于“利水消肿”药效的黄芪质量评价体系，最终以构建的药理平台对山西和甘肃黄芪进行评价；最后采用网络药理学、代谢组学和分子生物学探讨防己黄芪汤发挥药效的分子机制。除此之外，还对所依托的代谢组学技术流程关键步骤进行探讨，提出操作规程建议。研究结果为构建基于药效的黄芪质量评价方法提供研究思路，为发现和辨识黄芪发挥定向药效成分提供基础，为保障临床用药的有效性和准确性提供依据，对促进黄芪资源发展具有重要意义。 目的： （1）明确不同栽培方式、不同基原、不同产地黄芪的整体化学差异，构建基于核磁代谢组学技术的关联体外化学和体内代谢物变异的黄芪均一性和差异性评价方法； （2）构建黄芪基于“利水消肿”药效的药理平台，对不同来源黄芪进行质量评价； （3）从系统生物学和分子生物学角度阐释防己黄芪汤干预阿霉素肾病的分子机制； （4）探讨核磁代谢组学技术流程中的关键步骤，并提出规程建议。 方法： （1）通过考察不同的样本前处理方法，采用 1H NMR光谱系统表征黄芪的化学组成，结合多元统计分析阐释不同黄芪的化学差异；结合体外化学与体内代谢变异综合评价山西传统芪与甘肃移栽芪的质量差异，采用PLS双标图关联分析体外化学和体内内源性代谢物变异，构建中药黄芪一致性和差异性评价方法； （2）通过考察阿霉素不同给药方式和给药剂量，成功复制和优化阿霉素肾病模型；依据尿蛋白定量水平这一金指标确定防己黄芪汤干预阿霉素肾病大鼠的最佳造模体重、给药剂量和给药起始时间；设置黄芪、防己、缺黄芪或防己的阴性方、全方防己黄芪汤 5 个受试药物组，以大鼠一般状态、体重、脏器指数、尿蛋白定量水平、血清生化（肌酐、尿素氮；白蛋白、总蛋白；胆固醇、甘油三酯）、肾组织病理为传统药效指标，并采用 1H NMR代谢组学技术对不同组大鼠血清内源性代谢物进行分析，比较评价各受试药物的药效差异，明确黄芪对复方的重要贡献作用；采用相同的评价指标探究黄芪和防己黄芪汤对不同机体状态（肾病病理vs. 生理状态）的生物学响应差异；构建黄芪基于“利水消肿”功效的药理评价技术，对山西和甘肃黄芪进行评价； （3）采用网络药理学对防己黄芪汤作用于肾病综合征靶的靶点进行KEGG通路分析，预测分子机制；采用 1H NMR代谢组学技术分析大鼠血清、尿液、肾脏内源性代谢物的变化，以鉴定的病理标志物关联的靶点与上述靶点进行蛋白-蛋白相互作用，进一步探讨防己黄芪汤干预肾病综合征的药效机制；采用Western Blot测定肾组织中相关通路的关键蛋白：足细胞结构蛋白（nephrin、podocin）、纤维化相关蛋白（TGF-β1、α-SMA）、水通道蛋白AQP2以及与氧化应激相关蛋白Nrf-2和炎症相关蛋白TNF-α，进一步进行验证； （4）通过列举代谢组学技术在中药黄芪、食品绿豆和食醋以及动物体液和靶组织中的应用，探究其流程中样本收集与制备、数据处理等步骤中的关键问题，提出操作规程建议。 结果： （1）两相法能有效区分不同来源的黄芪；不同栽培方式对黄芪化学成分的影响远大于基原和产地的影响；山西传统芪与甘肃移栽芪的化学差异较大，但两者灌胃给药后对正常小鼠体内内源性代谢物的影响差异较小，结合体外化学和体内代谢变异可有效评价黄芪的一致性和差异性。 （2）确定造模药物（4+1）mg/kg为最佳造模方式和剂量；确定大鼠最佳造模起始体重为300 g，最佳给药起始时间为造模第15 d，最佳给药剂量为防己黄芪汤等效临床剂量（4.2 g/kg/d）；各受试药物对模型组大鼠传统药效指标以及内源性代谢物变异均有不同程度的回调，其中防己黄芪汤效果最优，黄芪次之，而缺黄芪的阴性方效果较差，验证了黄芪对复方的重要贡献；与空白组相比，正常大鼠给予单味药黄芪和防己黄芪汤，上述各传统病理指标均无显著变化，内源性代谢物（除与能量代谢相关的3个代谢物）均无统计学差异（p>0.05），表明药物在不同机体状态的生物学响应存在差异；与山西黄芪相比，甘肃黄芪能明显改善模型组大鼠体重、升高血清总蛋白和降低肌酐水平，回调81.2%的代谢物变异，利水效果较优； （3）网络药理学预测防己黄芪汤干预肾病综合征主要与 PI3K-Akt 信号通路介导的肾纤维化、MAPK信号通路与NF-κB信号通路介导的氧化应激反应以及Toll样受体介导的免疫反应与炎症反应等相关；基于核磁技术的血清、尿液以及肾组织代谢组学研究结果表明，防己黄芪汤发挥药效可能通过调节氨基酸生物合成和糖酵解/糖异生和 TCA 循环能量代谢等代谢途径，以及与氧化应激相关的低氧诱导因子（HIF-1）、与炎症相关的血管内皮生长因子（VEGF）和与免疫相关T细胞受体等信号通路，部分验证了网络药理学的预测结果；在分子水平上，防己黄芪汤通过上调podocin和nephrin，下调AQP2、TGF-β1、α-SMA和TNF-α发挥药效。 （4）代谢组学分析时，建议选择血清（优于血浆），收集时应于常温下凝结 40 min-2 h，分离效果最好，血清沉淀蛋白溶剂选择甲醇，且血清与甲醇的比例为1：2较好；核磁图谱积分区段选择应同时考虑‘图谱漂移’和‘数据维数’两个因素；数据矩阵的归一化、标准化以及统计分析都应考虑‘数据类型’和‘研究目的’，进行科学合理的选择，必要时进行验证；代谢通路分析建议综合多种软件进行相互佐证，必要时可采用同位素示踪技术进行跟踪判断。 结论： （1）核磁代谢组学技术可用区分不同来源的黄芪，且栽培方式对黄芪化学成分影响较大。 （2）防己黄芪汤对阿霉素肾病疗效确切，君药黄芪对复方药效具有重要贡献，黄芪和防己黄芪汤对不同生理和病理两种机体状态的生物学效应存在差异，基于黄芪“利水消肿”功效的药理平台可成功用于评价山西和甘肃不同栽培方式及其不同产地的黄芪。 （3）防己黄芪汤干预肾病的机制涉及能量代谢、酮体代谢和氨基酸代谢等多条代谢途径的紊乱，与足细胞结构和功能破坏、炎症反应、纤维化病变以及氧化应激损伤密切相关。 （4）代谢组学研究需要制定SOP标准化操作规程。
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