摘要
菜心(Brassica campestris L. ssp.chinensis var.utilis Tsen et Lee）作为集花薹、叶、茎为一体的叶菜类蔬菜，是华南地区的特色蔬菜。但是菜心采后极易木质化，严重影响了它的商品价值。目前，有关菜心采后衰老进程中木质化的分子机理鲜见报道，对于菜心采后贮藏尚缺乏安全高效的保鲜技术。本文对木质素生物合成途径中的两个关键酶即肉桂醇脱氢酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD）和漆酶（l accase,LAC）进行了功能研究，同时，对褪黑素在采后菜心保鲜中的保鲜效果进行了研究。研究结果如下： 1、分离了4个菜心木质素合成途径关键酶基因BcCAD4、BcCAD5和BcLAC4、BcLAC17，测序结果表明ORF长度分别为1098bp、1074bp、1686bp、1722bp，所编码氨基酸数目分别为365、357、561、573个。生物信息学分析表明：BcCAD4与B cCAD5同源性为71.40%，均含有肉桂醇脱氢酶家族的3个保守功能结构域：Zn1结合位点：[GHE(X)2(X)5G(X)2V]，Zn2结合位点：[GD(X)9.10C(X)2C(X)2C(X)7C]，NA DPH辅酶结合位点：[GXG(X)2G]；BcLAC4与BcLAC17同源性为59.05%，均含有漆酶家族4个Cu2+结合保守结构域。 2、实验通过酶切连接法，将4个目的基因与植物表达载体pOx连接，构建4个相应的超表达重组质粒：pOx-BcCAD4/BcCAD5/BcLAC4/BcLAC17。通过Overlapp ing PCR及Gibson Assimble方法构建4个目的基因的基因编辑载体：通过CRISPR/Cas9在线设计网站，于每个目的基因序列的起始区域及保守结构区域分别设计靶位点，构建了相应的单基因编辑载体：CRISPR/Cas9Pubi-H-AtU3b/lacZ-BcCAD4-sgRN A1-AtU3d/lacZ-BcCAD4-sgRNA2、CRISPR/Cas9Pubi-H-AtU3b/lacZ-BcCAD5-sgRNA1-AtU3d/lacZ-BcCAD5-sgRNA2、CRISPR/Cas9Pubi-H-AtU3b/lacZ-BcLAC4-sgRNA1-A tU3d/lacZ-BcLAC4-sgRNA2、CRISPR/Cas9Pubi-H-AtU3b/lacZ-BcLAC17-sgRNA1-At U3d/lacZ-BcLAC17-sgRNA2。 3、通过农杆菌介导法转化菜心。初步探索了菜心再生体系，以菜心子叶-子叶柄作为外植体，分化培养基为：MN培养基+2mg/L6-BA+0.45mg/LNAA+7.5mg/LAg NO3+2%蔗糖+0.7%琼脂，pH5.8，获得了最大分化频率38.3%。在体系优化过程中，发现平滑的外植体切口及切取子叶柄位置对菜心不定芽的分化有重要影响。目前4个目的基因的超表达载体转化处于第二次筛选阶段，4个目的基因的编辑载体转化处于转移生根前期。 4、4℃低温贮藏条件下，外源褪黑素处理可以显著延缓菜心贮藏0-9d内叶片叶绿素的降解，并对菜心可溶性糖及叶片可溶性蛋白含量的下降有一定的延缓作用。 5、褪黑素处理降低了菜心贮藏后期6-21d内的木质素含量；延缓了菜心MDA含量的升高、促进了POD、SOD酶活性的增强。4个目的基因的RT-PCR结果表明，褪黑素处理抑制了基因BcCAD4、BcCAD5的相对表达，对基因BcLAC4、BcLAC17的相对表达有一定的延缓作用。
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