摘要
桑椹是一种营养丰富，有益健康的果实。然而，桑椹菌核病是桑椹最为严重的真菌病害。桑椹菌核病的主要特征是病原菌会在感染的桑椹小核果内形成一个或者几个黑色的菌核。感病的小核果细胞死亡，色素丧失，最终失水成为枯白的僵果，因此在中国桑椹菌核病又称为桑椹白果病。 桑椹菌核病菌都是属于死体营养型的真菌。死体营养型真菌具有比活体营养型和半活体营养型真菌更为复杂的侵染机制。即使是死体营养型病原真菌的模式真菌核盘菌和灰霉菌，其致病机制也不是非常的清楚。况且，桑椹菌核病的病原菌有可能是专性寄生桑树的，其致病机制的研究是鲜有报道。研究病原菌的致病机制具有重要的理论和现实意义。然而，了解病原菌的致病机制只是解决病害问题的一方面，最终的降低病害发生的方法是要培育抗病耐病的桑树品种。研究菌核病菌触发的桑树的免疫反应是桑树抗病育种的理论基础。植物的天然免疫可以分为病原物相关分子模式触发的免疫反应（PTI,PAMP-triggered immunity）和效应因子触发的免疫反应（ETI,effector-triggered immunity）两个层面。PTI是一种低成本的，广谱性的免疫反应，对植物自身的生长副作用较小。研究桑树 PTI 反应对桑树广谱抗病耐病品种的选育具有重要的意义。 本研究克隆和鉴定到核地杖菌黑色素生物合成关键基因ShLAC1，并证明了黑色素和核地杖菌的致病性具有密切的联系。通过对感染菌核病三个不同时期的病果和对应时期的健康果的转录组测序，重点分析了防御相关的代谢途径和抗病相关基因的表达变化。从转录组数据中，鉴定到能够识别真菌几丁质的受体蛋白，然后对几丁质信号识别和传递相关的蛋白进行研究。本研究所获得研究结果如下： 1、ShLAC1是致病性相关的黑色素生物合成的关键基因 核地杖菌是桑椹缩小性菌核病的病原菌。菌株SX-001是分离自西南大学桑园的病果中。在人工培养基上，核地杖菌生长缓慢，并且会分泌黑色素。菌落停止生长后，菌落中间会分泌一圈微孢子，但是不能形成菌核。菌核可能只在病果中才能形成。病果小核果的石蜡切片显示，菌核的黑色外壁是由断裂黑化的菌丝聚集而成的。菌核的疏丝组织是由菌丝和小核果的组织混合组成的。 真菌的黑色素不仅有防御的作用，而且还与致病性相关。利用GC-MS鉴定了核地杖菌的黑色素是1,8-DHN类的黑色素。利用分子克隆技术我们获得了黑色素生物合成相关的基因ShLAC1。ShLAC1编码的漆酶负责催化1,8-DHN单体聚合形成1,8-DHN黑色素。为了验证ShLAC1在核地杖菌黑色素生物合成中的重要作用，我们通过农杆菌介导的RNAi技术获得了两株ShLAC1稳定沉默的转化子。ShLAC1沉默转化子不仅黑色素合成显著的降低，而且菌丝的营养生长也受到抑制。体外催化实验显示，ShLAC1沉默转化子的培养滤液催化单体1,8-DHN形成的黑色素要显著少于野生型菌株滤液的。这表明，ShLAC1是核地杖菌1,8-DHN黑色素生物合成的关键基因。 由于子囊孢子是桑椹菌核病唯一的初侵染源，而我们无法在人工培养基上获得核地杖菌的菌核，不能获得子囊孢子，也就无法直接验证ShLAC1沉默转化子的致病性是否有变化。因此，我们只能从其它方面来间接的验证ShLAC1沉默转化子致病性。草酸是菌核形成的植物病原真菌重要的致病因子。因此，我们把菌株产生草酸浓度的高低作为菌株致病力强弱的一个重要指标。通过 UPLC 检测表明，野生型菌株滤液草酸浓度为 2.13 mM，而 ShLAC1 沉默转化子检测不到草酸。同样地，黑色素合成另一个关键基因小柱孢酮脱水酶基因（ShSCD1）的沉默转化子iSCD的草酸产量也显著低于野生型的。用特异性的抑制黑色素合成过程中两个还原酶四羟基萘还原酶（4THNR）和三羟基萘还原酶（3THNR）活性的农药三环唑处理野生型菌株后，草酸的产生也显著的被抑制。这表明黑色素生物合成被抑制后，草酸的产生也随之被抑制。另外，我们还发现ShLAC1沉默转化子在PDA上的粘附力是降低的。综上结果表明，ShLAC1沉默降低了黑色素产生，并减弱了核地杖菌的致病力。 2、感染菌核病桑椹的转录组测序 我们选取感染菌核病早期（Stage 1），中期（Stage 2）和中后期（Stage 3）三个时期的病果，以及同时期健康的桑椹进行转录组测序。差异表达基因的统计结果发现，差异表达基因主要在感病中期（Stage 2）和中后期（Stage 3）大量出现，而在感病早期几乎没有差异基因。首先，我们对防御相关的代谢途径进行分析。结果表明，类黄酮生物合成途径和苯丙素生物合成途径富集大量的差异表达基因，如查尔酮异构酶基因（CHI），无色花青素双加氧酶基因（LDOX），无色花色素还原酶基因（LAR），双功能的双二氢黄酮醇还原酶/黄烷酮还原酶基因（DFR），查尔酮合成酶基因（CHS）和过氧化物酶基因（POD），肉桂醇脱氢酶基因（CAD），苯丙氨酸解氨酶基因（PAL），咖啡酸-O-甲基转移酶基因（COMT）在Stage 2或者Stage 3是上调表达的。然而，在与免疫密切相关的植物激素信号转导途径中，绝大部分的差异表达基因都是下调表达的。此外，从植物的两层免疫反应—PTI和ETI中，我们鉴定到19个钙离子信号转导相关的基因，其中超过一半的基因是上调表达的，以及许多质膜定位的受体蛋白差异表达基因。在这些质膜定位的受体蛋白中，我们还鉴定到13个含LysM的Unigenes。含LysM的蛋白可能涉及真菌几丁质信号触发的免疫反应。这是我们下一步要进行的研究。另外，我们还鉴定到属于第二层免疫反应ETI的66个上调表达的R基因。 3、MmLYK2的LysM1是MmLYK2与MmLYP1互作的关键基序 几丁质信号识别蛋白是一类含有LysM的质膜定位的蛋白。综合桑椹的转录组和桑树基因组数据，我们鉴定到11个含LysM的类受体蛋白，其中9个受体激酶（LYKs）和2个受体蛋白（LYPs）。MmLYP1 的表达受真菌和几丁质的诱导，并且，MmLYP1是CEBiP的同源蛋白，是一个GPI锚定蛋白。MmLYP1的N端有一段23个氨基酸残基的信号肽，中间有两个LysM，以及C端一段疏水结构，预测的糖基磷脂酰肌醇修饰位点ω是334N。因此，MmLYP1很可能是几丁质的识别受体。 为了验证 MmLYP1 具有几丁质亲和性，我们分别用不溶性多糖几丁质磁珠，几丁质，壳聚糖，纤维素和木聚糖与桑树总蛋白（桑果）孵育，然后用MmLYP1特异的多克隆抗体检测目标蛋白。WB结果表明，MmLYP1能够特异的被不溶性几丁质（几丁质磁珠和几丁质）拉下来。并且，在本氏烟中瞬时表达的GFP标记的MmLYP1融合蛋白也可以被几丁质拉下来。 由于MmLYP1缺乏胞内结构，其识别的几丁质信号需要另一个有胞内激酶的蛋白传递。因此，我们从9个受体激酶中筛选到最有可能是MmLYP1下游蛋白的MmLYK2。亚细胞定位表明MmLYP1和MmLYK2都位于质膜上。通过Y2H，BiFC和Co-IP证明了MmLYP1和MmLYK2可以相互作用。 MmLYP1 和MmLYK2 的互作是几丁质信号传递的重要步骤。由于 MmLYP1只含有胞外结构，因此MmLYP1和MmLYK2的互作是发生在胞外结构域。LysM是 MmLYP1 和MmLYK2仅有的被预测的胞外结构域，因此二者的互作可能与LysM有关。二级结构分析显示，MmLYP1与CEBiP和AtCEBiP结构非常相似，都含有两个LysM，且相应的LysM序列比较相近。然而MmLYK2有两个LysM，而AtCERK1和OsCERK1分别有三个和一个LysM基序。在酵母中，MmLYK2的LysM1可以分别与MmLYP1和MmLYK2的四个LysM发生互作。在酵母和烟草中，缺失LysM1的MmLYK2嵌合体不能与MmLYP1和MmLYK2互作。这表明MmLYK2的LysM1是MmLYK2与MmLYP1及其自身相互作用的关键基序。
NETL