摘要
背景： 脊髓损伤(SCI)是一种常见的高致残率的中枢神经系统损伤，其确切病理学机制尚不明确，目前尚无特效疗法，因此探索其致病机制，寻找有效干预措施显得尤为迫切。细胞自噬是一种降解错误折叠蛋白和受损细胞器，维持细胞稳态的重要机制。生理情况下，中枢神经系统，尤其是神经元中存在的基础水平的自噬对维持细胞稳态，提供细胞所需能量和原料至关重要。病理情况下，自噬在神经退行性疾病如阿尔茨海默症，中枢神经系统损伤如创伤性脑损伤等疾病的发生发展中起重要作用。虽然对自噬是保护性或有害的机制仍然存在争议，但多项研究认为调控自噬有望成为这些疾病的有效治疗策略。人参皂苷Rb1（Rb1）是从人参中提取的主要活性成分之一，具有广泛的抗炎、抗氧化、免疫调节等作用。大量研究表明Rb1还具有神经保护效应，如 Rb1 可减轻大鼠脑缺血再灌注损伤。另一方面，研究显示人参皂苷Rb1能调节自噬水平。然而自噬是否参与 Rb1 对 SCI的保护作用并不清楚。 目的： 本课题研究人参皂苷 Rb1 对脊髓损伤的神经保护作用，并进一步探讨自噬是否介导了这种保护作用及其相关机制。 研究方法： 1. 建立大鼠脊髓压迫性损伤模型，腹腔注射Rb1（20mg/kg）进行治疗。WB检测LC3、Beclin1、p62等自噬相关蛋白和Bcl-2、Bax和cleaved Caspase-3等凋亡相关蛋白。LC3 和 NeuN 双重免疫荧光染色检测神经元自噬水平。TUNEL检测细胞凋亡。BBB 行为学评分及斜板实验评估 SCI 后大鼠运动功能恢复。HE染色、尼氏染色检查组织病理学改变。 2. 制备体外培养细胞化学性损伤模型。人参皂苷Rb1或人参皂苷Rb1加雷帕霉素预处理2h后，过氧化氢（10μM）处理PC12细胞6h。WB检测LC3、Beclin1、p62等自噬相关蛋白和Bcl-2、Bax和cleaved Caspase-3等凋亡相关蛋白。LC3免疫荧光染色检测自噬水平,CCK8检测细胞活性。 3. 制备体外培养细胞物理性损伤模型。人参皂苷Rb1或人参皂苷Rb1加雷帕霉素预处理2h后，对PC12细胞进行划痕试验。计算划痕区域不同时间点的愈合率。LC3免疫荧光染色检测自噬水平。 研究结果： 1. 人参皂苷Rb1显著改善SCI大鼠的BBB评分，增加斜板试验角度，增加脊髓横断面完整白质的面积，减少前角运动神经元的丢失。 2. SCI组LC3、Beclin1蛋白表达显著上升，p62蛋白表达显著下降，前角神经元LC3荧光信号显著增加，提示SCI后自噬被激活。Bcl-2蛋白表达量显著下降，Bax和cleaved Caspase-3表达量显著升高，TUNEL阳性细胞比例显著增多，提示SCI上调了凋亡水平。而人参皂苷Rb1显著下调SCI所激活的自噬和凋亡。 3. 体外实验显示过氧化氢诱导氧化损伤后LC3、Beclin1蛋白表达显著上升，p62蛋白表达显著下降，LC3免疫荧光阳性率显著增加，提示自噬激活。Bcl-2蛋白表达量显著下降，Bax和cleaved Caspase-3表达量显著升高，提示凋亡增加。而人参皂苷Rb1显著下调氧化损伤所激活的自噬和凋亡水平。氧化损伤后细胞存活率显著下降，人参皂苷Rb1显著提高细胞存活率，而自噬激动剂雷帕霉素能显著削弱Rb1的作用。 4. Rb1增加PC12细胞划痕区域24小时的愈合率。在损伤区域与非损伤区域相比LC3免疫荧光强度显著增加。Rb1 抑制划痕试验所的诱导的 PC12 细胞自噬和细胞死亡。 结论： 人参皂苷Rb1减少大鼠SCI后自噬的激活，减少神经元的凋亡，减少神经元丢失，改善运动功能恢复。人参皂苷Rb1通过抑制自噬发挥体外的神经保护作用。对自噬的抑制是Rb1治疗SCI的可能机制之一，有望成为治疗SCI药物开发的潜在靶点。
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