摘要
目的：本研究首先以亲本细胞Hep3B作为为研究对象，采用体外药物间歇诱导法建立紫杉醇耐药细胞株Hep3B/TAX；其次通过MTT，分子干扰技术，流式细胞术，蛋白免疫印迹技术，荧光定量PCR研究Lin28B/let-7通路与HCC细胞紫杉醇耐药相关性；最后将姜黄素与紫杉醇联合应用，通过MTT，蛋白免疫印迹技术，荧光定量PCR和免疫荧光技术研究姜黄素对紫杉醇诱导的 NF-κB与Lin28B表达影响，探寻姜黄素通过NF-κB/Lin28B/let-7增敏紫杉醇抑制肝癌细胞增殖与诱导凋亡的可能性，为姜黄素逆转肝癌紫杉醇耐药应用于临床提供理论依据。 方法：1.通过体外细胞药物间歇诱导法建立Hep3B/TAX耐药细胞株，并通过显微镜观察，药物敏感实验和流式细胞术对Hep3B/TAX细胞进行鉴定。2.荧光定量PCR和Western Blot实验检测Hep3B和Hep3B/TAX细胞中Lin28B在基因和蛋白方面表达水平；运用分子干扰技术上调或下调Lin28B表达水平，再次使用荧光定量PCR和Western Blot实验检测Lin28B在基因和蛋白方面表达水平，MTT法检测紫杉醇对Hep3B/TAX细胞增殖活力影响，流式细胞术检测紫杉醇对Hep3B/TAX细胞凋亡的影响，Western Blot实验检测紫杉醇对耐药细胞中相关凋亡蛋白表达影响；通过荧光定量PCR检测了Hep3B和Hep3B/TAX细胞中let-7家族的表达水平，Western Blot实验检测Hep3B和Hep3B/TAX细胞中相关凋亡蛋白表达。3.MTT法检测不同浓度姜黄素以及姜黄素与紫杉醇联合应用对耐药细胞增殖的影响，蛋白质印迹法检测姜黄素与紫杉醇联合应用对耐药细胞中凋亡相关蛋白表达的影响，荧光定量PCR检测姜黄素与紫杉醇联合应用对耐药细胞中Lin28B基因表达的影响，蛋白质印迹法检测姜黄素与紫杉醇联合应用对耐药细胞中Lin28B及NF-κB蛋白表达的影响，免疫荧光技术检测姜黄素与紫杉醇联合应用对耐药细胞中NF-κB活性的影响，免疫组化技术检测姜黄素与紫杉醇联合应用对耐药细胞中Lin28B及NF-κB表达影响。 结果：1.成功建立Hep3B/TAX耐药细胞株，并完成对耐药细胞株的鉴定。2.荧光定量PCR和Western Blot实验检测发现Lin28B在Hep3B/TAX细胞呈高表达状态，初步说明Lin28B表达与紫杉醇耐药相关。沉默Hep3B/TAX细胞中Lin28B基因后，与阴性对照组相比Hep3B/TAX细胞中Lin28B在基因和蛋白方面表达水平明显降低。同时进行回复实验过表达Hep3B/TAX细胞中Lin28B基因，结果表明Lin28B表达水平明显增高，反向验证Lin28B与HCC细胞紫杉醇耐药的作用关系。荧光定量PCR结果显示，与Hep3B细胞相比，Hep3B/TAX细胞中let-7家族7个成员表达水平都显著降低，Hep3B/TAX细胞中Bcl-xL，Bcl-2，caspase9，caspase3蛋白表达水平明显增高；Bax表达水平明显降低。3.姜黄素对Hep3B/TAX细胞增殖有明显的抑制作用，姜黄素对Hep3B/TAX细胞的IC50为34.99±2.43μmol/L。MTT法检测姜黄素与紫杉醇的协同作用，结果显示当紫杉醇与姜黄素联合应用时，紫杉醇对Hep3B/TAX细胞中的IC50呈剂量依赖性显著降低。紫杉醇与姜黄素联合使用后，Hep3B/TAX细胞凋亡率显著增加，凋亡蛋白表达量升高，Lin28B及NF-κB表达下降，NF-κB转录活性降低。 结论：综上所述，通过对Lin28B/let-7通路与HCC细胞紫杉醇耐药相关性进行初步研究发现HCC细胞中Lin28B激活后，可抑制let-7表达，导致HCC细胞凋亡减少，促进肿瘤发展。NF-κB被激活后可诱导Lin28B的高表达，进而阻断let7-miRNA的成熟，抑制肿瘤细胞凋亡。姜黄素可以抑制NF-κB活性，下调Lin28B表达，抑制细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡。因此，我们研究结果暗示姜黄素可能通过NF-κB/Lin28B/let-7通路增敏紫杉醇抑制肝癌细胞的增殖与诱导细胞凋亡。
NETL