摘要
炎症被广泛的报道与口腔舌鳞状细胞癌关系密切，但是具体的机制仍不明了。TLR2在口腔慢性炎症相关的疾病中扮演着重要的角色，但是它与舌癌的关系未知。在本实验中，我们使用4-NQQ诱导TLR2-/-和WT小鼠舌黏膜癌变。小鼠舌组织病理学结果显示TLR2-/-组小鼠舌癌进展在各时间点均快于WT组小鼠。在体外实验中我们发现TLR2-/-小鼠体内的单核细胞更易诱导为M2型巨噬细胞，免疫组化结果显示在舌癌形成过程中TLR2-/-组小鼠舌下M2型巨噬细胞浸润的数目远高于WT组，即TLR2-/-舌下高密度的M2型巨噬细胞导致了舌癌进展快于WT。在本实验中我们发现了TLR2在舌癌的发生发展中扮演着积极的作用，且由其介导的调控M2型巨噬细胞的分化及浸润来抑制舌癌的发展。这些发现或许能给舌癌的免疫治疗提供新的思路。 背景与目的 全球每年大约有2％的新发生癌症为口腔癌，且在口腔癌中口腔舌鳞状细胞癌（oral tongue squamous cell carcinoma，OTSCC）所占的比例最高约40%左右[1,2]。由于舌癌的机制不明，近年来尽管提出了诸如：外科手术、放射治疗、化学疗法、免疫治疗以及多学科联合等新的治疗方法，但患者的五年生存率仍没有明显提高，仍保持在50％左右[3,4]。因此，阐明舌癌的分子机制变得越来越重要，课题组希望通过研究舌癌发生发展的机制，从而来寻找针对舌癌更加有效的治疗方法。 目前舌癌与慢性炎症的关系被广泛的报道[5]。其中TLRs受体（Toll like receptors,TLRs）作为炎症起始，被认为是获得性免疫和固有免疫的之间连接的桥梁，为病原相关分子模式(pathogen-associated molecule pattern,PAMP)和损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs)受体家族成员，其在慢性炎症中扮演着重要的角色[6,7]。自从TLRs被首次发现以来，人和小鼠体内共发现10个TLRs（TLR1至TLR10）和3个假基因（TLR11至TLR13）。这些受体在口腔免疫防御系统中发挥重要作用，通过识别特异性配体如内毒素、肽聚糖、鞭毛蛋白、双链RNA以及酵母细胞壁上的甘露糖以及内源性配体等，来介导免疫及炎症反应，维持内环境稳态[8]。且其高表达在多种肿瘤细胞表面，在肿瘤中它们不但与肿瘤相关的炎症关系密切，还在肿瘤介导的免疫抑制中发挥着重要的作用[9,10]。 目前在TLRs与肿瘤关系的研究中，TLR2为研究的热点，不仅仅是由于它高表达在单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、以及骨髓来源的抑制细胞等免疫细胞表面[11]，此外它还广泛参与许多肿瘤的发生发展[10]。大量文献报道了TLR2与肿瘤发生之间的关系，在肝癌的研究中，Lin报道了TLR2抑制肝癌的发展，敲除TLR2基因的小鼠肝脏内细胞自噬及细胞凋亡减少且浸润的巨噬细胞的数目明显下降，这两者导致了TLR2-/-小鼠肿瘤进展较快[12]。Li同样报道了TLR2在肝癌的发展中扮演着积极的作用，TLR2基因的缺失导致了胱天蛋白酶-8和IL-18轴的激活，这导致了MDSC在肝脏中的浸润增加，TLR2-/-小鼠肝脏内高比例的MDSC介导的免疫抑制导致了肝癌进展快与WT型小鼠[13]。然而在对人肝癌细胞系的研究中，Shi却报道了下调TLR2会导致HCC细胞系的活性下降[14]。在TLR2与结肠直肠癌的研究中，Lowe报道了小鼠缺失TLR2基因导致由炎症诱导的鼠结肠直肠癌进展较快，这是由于TLR2-/-小鼠体内免疫系统功能紊乱，在其体内形成的炎性环境加速了肿瘤的生长[15]。Sheeran却报道了在TLR2及MYD88缺失的小鼠体内，自发的肿瘤数目明显下降[16]。对于胃癌，STAT3信号通路的激活使得胃癌细胞和胃上皮中的TLR2高表达，且高表达的TLR2受体促进了胃癌的发展，在小鼠模型中靶向的降低TLR2能减慢小鼠胃癌的发展[17]。在人舌癌组织中，TLR2高表达在各种类型和各阶段的舌癌中，并且与舌癌的发生发展浸润以及愈后有着高相关性[18,19]。总之，TLR2在肿瘤发生发展中均发挥着重要的作用，且与巨噬细胞等免疫细胞功能异常关系密切，但其在舌癌中的作用尚不清楚。 在本实验中，我们使用4-硝基喹啉1-氧化物（4-nitroquinoline 1-oxide，4-NQQ）诱导WT和TLR2-/-小鼠舌黏膜癌变，并且通过对比两组差异，得出敲除TLR2促进了舌癌的发展的结论。 我们还统计了在两组小鼠舌癌形成过程中M2型巨噬细胞的变化。结果表明TLR2基因的缺失使得M2巨噬细胞更多的浸润到肿瘤微环境中。在体外实验中，发现来自TLR2-/-小鼠的单核细胞，对比WT小鼠更容易诱导为M2型巨噬细胞。这些都表明了，TLR2可能是通过调控M2型巨噬细胞的分化及浸润，来抑制小鼠舌癌的发展。 实验方法 实验一：200只WT和200只TLR2-/-小鼠被随机分为四大组，包括TLR2-/-实验组、TLR2-/-对照组、WT实验组、WT对照组，每大组又分为五小组，每小组共10只小鼠（雌雄随机）。在实验组小鼠的饮用水中加入4-NQQ（0.004%），在喂水后的8周、12周、16周、20周、24周时分别处死TLR2-/-和WT实验组及对照组中的一小组。处死后取小鼠舌，4%多聚甲醛固定24～48h、病理科脱水、包埋、切片（0.4um）、HE染色。病理学分析（双盲实验）打分后，比较两组小鼠舌黏膜癌变的差异。 实验二：使用CD206标记M2型巨噬细胞，免疫组化染色（Envision两步法）。每张切片在高倍镜视野下，随机取10个典型视野，双盲实验统计视野下的M2型巨噬细胞数目，统计学分析，对比两组小鼠舌癌形成过程中舌下M2型巨噬细胞浸润的差异。体外实验中，我们提取TLR2-/-及WT小鼠股骨骨髓内单核细胞，体外诱导为M2型巨噬细胞，观察两组差异。 结果 实验一：在WT和TLR2-/-对照组中，小鼠舌及整体状态除増龄性变化外，其余无异常。实验组小鼠在舌癌形成过程中，无论是从小鼠的整体状态还是舌外观，TLR2/-组小鼠的舌癌进展均快于WT组小鼠。组织病理结果如下：对照组小鼠在各时间点舌黏膜均无明显改变，且对比两组舌粘膜未见明显差异。对于实验组，在8周时WT组舌黏膜无明显异常，TLR2-/-4只（40%）出现轻度异常增生(P=0.029)。在12周时WT组有7只(70%)出现轻度异常增生，TLR2-/-组则4只(40%)轻度异常增生、6只(60%)中度异常增生(P=0.002)。在16周时，所有的WT(100%)均出现轻度异常增生，TLR2-/-组2只(20%)轻度异常增生、7只(70%)中度异常增生、1只(10%)重度异常增生(P=0.000)。在20周时3只(33.33%)出现轻度异常增生、4只(44.44%)中度异常增生、2只(22.22%)重度异常增生，TLR2-/-组2只(20%)中度异常增生、8只(80%)重度异常增生(P=0.009)。在24周时，WT组2只(20%)轻度异常增生、6只(60%)中度异常增生、1只(10%)出现中度异常增生、1只(10%)出现浸润癌，TLR2-/-组1只(12.5%)轻度异常增生、2只(25%)重度异常增生、5只(62.5%)出现浸润癌(P=0.018)。 实验二：镜下观察CD206标记的巨噬细胞呈纺锤形和圆形，典型视野中可见M2型巨噬细胞主要分布在基底膜附近，小部分散落在舌肌中。且在舌癌的形成过程中，舌下M2型巨噬细胞浸润的数目均随着肿瘤的进展而增加，TLR2-/-组舌下M2型巨噬细胞浸润在各时间点均高于WT组。体外实验中，我们发现来自TLR2-/-小鼠的单核细胞，对比WT小鼠更容易诱导为M2型巨噬细胞。 结论 1.TLR2-/-组小鼠的舌癌进展在各个时间点均快于WT组小鼠，提示TLR2抑制舌癌的发展。 2.免疫组化结果显示TLR2-/-组小鼠舌下M2型巨噬细胞浸润的数目在各时间点均高于WT组，体外诱导实验提示TLR2-/-型单核细胞更易诱导为M2型巨噬细胞，提示TLR2有可能是通过调控M2细胞的分化及浸润来调控舌癌的发生发展。
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