摘要
胶质瘤是一种常见的恶性脑肿瘤,尽管发生率只占所有脑肿瘤40%,然而却占恶性脑肿瘤80%.胶质瘤患者临床主要采用手术、放疗和化疗的方法进行治疗,但大多数预后较差.因此,积极探索胶质瘤发生机制以发现新的治疗方法或干预措施具有重要意义.胶质瘤领域的一系列最新进展为此提供了可能. 表观遗传是指DNA序列不发生改变前提下的遗传效应,包括DNA甲基化、RNA干扰和组蛋白翻译后修饰(PTM)等.组蛋白是染色体基本组分,一方面作为结构支架维持了染色体完整性,另一方面通过影响DNA特定区域基因表达活性而发挥重要调控作用.组蛋白存在广泛翻译后修饰,最常见有乙酰化、甲基化、泛素化和磷酸化等,这些修饰通过转录激活或抑制而最终影响特定基因表达. 甲基化是一种常见组蛋白修饰,主要集中在组蛋白H3和H4的赖氨酸与精氨酸残基,其中以H3赖氨酸残基研究最为广泛.组蛋白特定位点可发生一甲基化、二甲基化和三甲基化等修饰,以4位赖氨酸(H3K4)、9位(H3K9)、27位(H3K27)和36位(H3K36)最常见. JMJD3(Jumonji domain-containing protein 3)是一种H3K27去甲基化酶,主要催化二和三甲基化H3K27 （H3K27me2/3 )去甲基化,由于H3K27me2/3是一种转录抑制标志,因此JMJD3具有转录激活作用.JMJD3在多种癌症包括肺癌、前列腺癌、肾癌等存在表达或活性异常,但在胶质瘤中作用与机制研究较少.因此本研究一方面探索JMJD3在胶质瘤发生中的作用与机制,以拓展对胶质瘤发生的理解与认识;另一方面开展基于JMJD3的转化研究,以期为胶质瘤治疗和预防提供新策略. 第一部分 组蛋白去甲基化酶JMJD3在胶质瘤侵袭过程中的作用与机制 目的:探索组蛋白去甲基化酶JMJD3在胶质瘤侵袭过程的作用及潜在机制,以期为胶质瘤诊断、治疗和预防提供重要靶点. 方法:两种人胶质瘤细胞系U87和U251购于中国医学科学院基础医学研究所.两种细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液,并放置于37℃、5%CO2细胞培养箱.采用Lipo3000分别将质粒CRISPRi或CRISPRa转入两种胶质瘤细胞,利用qRT-PCR、免疫印迹检测JMJD3抑制或过表达情况.采用划痕实验检测两种胶质瘤细胞在JMJD3抑制或过表达情况下细胞迁移能力.采用transwell实验比较两种胶质瘤细胞在JMJD3抑制或过表达前提下侵染能力差异.借助qRT-PCR和免疫印迹检测JMJD3抑制或过表达对EMT重要基因SNAI1表达的影响,进一步采用染色质免疫共沉淀(ChIP)技术鉴定SNAI1基因启动子区JMJD3结合能力差异和H3K27me3水平变化. 结果: 1.组蛋白去甲基化酶JMJD3在胶质瘤组织过表达 Oncomine数据库分析显示,与正常脑组织(10例)相比,胶质母细胞瘤(542例)中JMJD3表达显著上升(P<0.05),初步说明JMJD3与胶质瘤发生密切相关. 2.CRISPRi和CRSIPRa方法可抑制或增加组蛋白去甲基化酶JMJD3在胶质瘤细胞中表达 qRT-PCR、免疫印迹和免疫荧光实验表明,CRISPRi-JMJD3可显著抑制 JMJD3 表达（P<0.05 )，同时增加组蛋白 H3K27me3 含量.CRISPRa-JMJD3则明显增加 JMJD3 表达（P<0.05 )，并降低组蛋白H3K27me3水平.这些结果表明,CRISPRi/a技术是一种高效、快捷调控细胞内源基因表达的研究策略. 3.组蛋白去甲基化酶JMJD3可影响细胞迁移和侵袭 划痕实验表明,下调JMJD3表达可显著抑制两种胶质瘤细胞迁移能力,而过表达JMJD3则使细胞迁移率明显加强(P<0.05).Transwell实验进一步表明,JMJD3表达量与细胞侵袭力呈正相关(P<0.05). 4.组蛋白去甲基化酶JMJD3可与SNAI1基因启动子区结合并降低组蛋白H3K27me3水平,进而上调SNAI1表达. CRISPRi/a实验表明,JMJD3表达还与EMT重要基因SNAI1表达具有一致性,为此进一步采用ChIP实验证明JMJD3可与SNAI1基因启动子区结合,由于JMJD3本身组蛋白H3K27去甲基化酶活性和转录激活效应,从而说明JMJD3促进细胞侵袭和迁移部分通过上调SNAI1基因表达实现. 小结:组蛋白去甲基化酶JMJD3是一种重要的胶质瘤发生促进因子,可通过上调EMT相关因子SNAI1表达而促进胶质瘤细胞侵袭和迁移.这一发现对胶质瘤诊疗具有重要意义. 第二部分 组蛋白去甲基化酶JMJD3抑制剂GSK-J4对胶质瘤的影响 目的:研究组蛋白去甲基化酶JMJD3抑制剂GSK-J4对胶质瘤细胞增殖、凋亡和迁移等的影响. 方法:胶质瘤细胞U87、U251及内皮细胞hCMEC培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液,并放置于37℃、5%CO2细胞培养箱.首先采用qPCR和WB检测三种细胞JMJD3表达,使用不同浓度GSK-J4处理三种细胞后比较JMJD3和H3K27me3含量变化以确定生理活性;随后采用CCK-8实验检测浓度梯度和时间梯度的GSK-J4处理对三种细胞增殖的影响;进一步采用流式细胞术比较GSK-J4对细胞凋亡的影响;最后采用划痕实验观察GSK-J4对两种胶质瘤细胞迁移能力的影响. 结果: 1. 胶质瘤细胞存在JMJD3过表达 qPCR和免疫印迹结果表明两种胶质瘤细胞JMJD3 mRNA和蛋白表达量显著高于内皮细胞,差异显著(P<0.05);与此同时,胶质瘤细胞H3K27me3含量相应减少,暗示JMJD3过表达及H3K27低甲基化可能是胶质瘤细胞特征之一,因此JMJD3并可作为一种潜在治疗靶点. 2. 组蛋白去甲基化酶抑制剂GSK-J4增加H3K27me3含量 免疫印迹结果显示GSK-J4可显著增加胶质瘤细胞U87和U251中H3K27me3含量,然而却对内皮细胞无显著影响,这一结果说明GSK-J4具有组蛋白H3K27me3去甲基化酶抑制活性. 3. GSK-J4对胶质瘤细胞增殖的抑制作用 应用CCK8实验表明GSK-J4对两种胶质瘤细胞U87和U251具有明显抑制作用,并且这种抑制作用既具有浓度依赖性(P<0.05),又具有时间依赖性(P<0.05);但对内皮细胞无影响.这一结果表明GSK-J4是一种胶质瘤细胞特异性增殖抑制剂. 4. GSK-J4对胶质瘤细胞凋亡的诱导作用 流式细胞分析结果表明显示GSK-J4可显著诱导两种胶质瘤细胞U87和U251凋亡增加(P<0.05),对hCMEC细胞凋亡无明显影响.这说明GSK-J4是一种胶质瘤特异性细胞凋亡诱导剂,具有相对较高的安全性. 5. GSK-J4抑制胶质瘤细胞迁移能力 细胞划痕试验表明GSK-J4可降低两种胶质瘤细胞U87和U251迁移能力(P<0.05和P<0.01),从而说明GSK-J4在胶质瘤转移抑制方面也有重要潜力. 小结:JMJD3特异性抑制剂GSK-J4可选择性抑制胶质瘤细胞增殖和迁移,促进细胞凋亡,这一发现为胶质瘤治疗提供了新策略. 第三部分 组蛋白去甲基化酶JMJD3在1,25-二羟基维生素D3诱导的胶质瘤细胞衰老中的作用与机制 目的:研究JMJD3在1,25-二羟基维生素D3诱导的胶质瘤细胞衰老中的作用及潜在机制,从而为胶质瘤预防及辅助治疗提供一种重要方案. 方法:采用SA β-gal 显色法检测1,25-二羟基维生素D3对两种胶质瘤细胞U87和U251细胞衰老的影响.qRT-PCR检测JMJD3、维生素D受体(VDR)和细胞衰老标志物INK4A的mRNA表达,利用免疫印迹和免疫荧光法检测JMJD3、VDR、INK4A和H3K27me3的蛋白含量变化.转染JMJD3 siRNA后使用qRT-PCR和免疫印迹法验证效果,采用SA β-gal 显色法比较1,25-二羟基维生素D3对JMJD3干扰后细胞衰老的影响.采用染色质免疫共沉淀(ChIP)检测INK4A调控区JMJD3和VDR结合情况及H3K27me3含量变化. 结果: 1. 1,25-二羟基维生素D3增加了胶质瘤细胞衰老 SA β-gal 显色法表明,1,25-二羟基维生素D3处理可显著增加胶质瘤细胞U87和U251细胞衰老的发生(P<0.05),从而达到抑制细胞增殖的目的,初步说明1,25-二羟基维生素D3对胶质瘤也具有一定抑制效应. 2. 1,25-二羟基维生素D3增加了组蛋白去甲基化酶JMJD3表达和细胞衰老标志物INK4A表达 qRT-PCR、免疫印迹和免疫荧光结果表明,1,25-二羟基维生素D3可增加胶质瘤细胞组蛋白去甲基化酶JMJD3在mRNA和蛋白水平的表达(P<0.05),此外还增加INK4A的表达量(P<0.05),从而说明JMJD3和INK4A表达上调可能参与了1,25-二羟基维生素D3诱导的细胞衰老. 3. 抑制JMJD3减弱了1,25-二羟基维生素D3诱导的细胞衰老 采用RNA干扰技术降低JMJD3表达,可显著抑制1,25-二羟基维生素D3诱导的细胞衰老发生和INK4A的表达上调(P<0.05),进一步说明JMJD3介导了1,25-二羟基维生素D3诱导的细胞衰老. 4. JMJD3直接调控了1,25-二羟基维生素D3诱导的INK4A表达 ChIP实验结果表明，1,25-二羟基维生素D3可显著增加JMJD3和VDR 与 INK4A 启动子区的结合,同时减少组蛋白 H3K27me3 水平(P<0.05),这一结果表明JMJD3催化的INK4A启动子区H3K27me3去甲基化是1,25-二羟基维生素D3诱导INK4A表达进而促进细胞衰老的机制之一. 小结:1,25-二羟基维生素D3可促进胶质瘤细胞衰老,其机制在于增加JMJD3表达,而JMJD3可进而与维生素D3受体(VDR)协同与INK4A基因启动子区结合,通过催化该区域H3K27me3去甲基化而增加INK4A表达.这一发现对胶质瘤预防和辅助治疗具有重要价值. 结论:胶质瘤组蛋白去甲基化酶JMJD3表达高于癌旁组织,增加或抑制JMJD3表达可增强或减弱胶质瘤迁移能力,并通过影响SNAI1基因调控区H3K27me3水平而调节胶质瘤侵袭过程.组蛋白去甲基化酶JMJD3抑制剂GSK-J4可特异性抑制胶质瘤细胞质增殖和迁移,促进细胞凋亡,而对内皮细胞无明显影响.1,25-二羟基维生素D3可促进胶质瘤细胞衰老,其机制之一1,25-二羟基维生素D3可增加JMJD3表达,而JMJD3可进一步通过催化INK4A基因调控区H3K27me3去甲基化而增加INK4A表达,从而增加细胞衰老发生.这些结果对胶质瘤诊疗具有重要意义.
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