摘要
脓毒症心脏功能障碍(sepsis-induced myocardial dysfunction，SIMD)是脓毒症导致的心肌损伤，主要表现为心肌收缩功能障碍、心脏扩大以及左室射血分数(Left Ventricular Ejection Fractions，LVEF)下降。约有50%的脓毒症患者会出现心脏功能障碍，其死亡率高达70-90%，是脓毒症患者死亡的主要原因。目前，关于SIMD的发病机制尚未完全阐明，其中炎症反应被认为是脓毒症的发病基础，近几年发现，脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)可通过激活Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)通路导致内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，进而在脓毒症导致的多器官损伤中发挥重要作用，成为目前的研究热点。硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)是继一氧化碳(carbon monoxide，CO)和一氧化氮(nitric oxide，NO)之后发现的第三种气体信号分子，研究表明，H2S不仅可由机体内源性生成参与体内众多系统的生理过程，并且在一些疾病的病理生理过程中发挥了重要作用。目前，H2S 在炎症反应中的作用仍存在争议，H2S能否通过抑制TLR4减轻炎症反应及ERS，发挥其心脏保护作用？至今国内外未见相关报道。 本研究拟采用经胸超声心动图、苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，HE染色)、酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)及蛋白质免疫印迹(Western blot，WB)等技术，从功能学、形态学、蛋白表达等方面观察H2S对SIMD小鼠心脏功能的影响，探讨其作用机制，并进一步评价外源性H2S对LPS所致SIMD的治疗作用，为SIMD的治疗提供新思路。本研究共分五部分。 第一部分 硫化氢与脓毒症心脏功能障碍患者心功能相关性的临床观察 目的：观察SIMD患者血浆H2S水平与心功能的关系。 方法：本实验选取河北医科大学第四医院重症医学科(intensive care unit，ICU)10例SIMD患者作为病例组(SIMD组)，匹配选取10例该院健康体检者作为对照组(Control组)。入选患者均已签署知情同意书。患者入组后即刻记录一般情况及生命体征，留取静脉血检测血浆白细胞(white blood cell，WBC)浓度，血浆肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)的含量，血浆肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)浓度，以及血浆H2S的浓度，并尽快行心脏超声检查，测量心功能指标LVEF以及左室缩短分数(Left Ventricular fractional shortening，LVFS)。 结果： 1.两组间性别、年龄、体重无差异，既往均无冠心病史。SIMD患者存在明确的感染灶，其中3例为呼吸道感染，4例为腹腔感染，2例为泌尿系感染，1例为肠源性感染。与Control组相比，SIMD组患者体温升高、心率加快、呼吸加快、WBC升高、LVEF＜50%，符合临床SIMD诊断。 2.与Control组相比，SIMD组患者心功能改变主要表现为左室扩张、室壁运动减弱，LVEF和LVFS显著降低，提示SIMD患者主要表现为左室收缩功能障碍。 3.与Control组相比，SIMD组患者血浆cTnI、CK明显升高，提示存在心肌细胞损伤。 4.与Control组相比，SIMD组血浆TNF-α和IL-1β水平均明显升高，提示存在炎症反应。 5.与Control组相比，SIMD组患者血浆中H2S水平明显下降。 6.血浆H2S水平分别与LVEF和LVFS呈显著正相关。 结论：SIMD患者主要表现为心肌收缩功能障碍，同时伴有心肌细胞损伤，血浆炎症因子水平升高，而内源性H2S水平下降，并且内源性H2S水平与心功能指标LVEF、LVFS均呈正相关。推测内源性H2S减少可能参与了SIMD的发病过程，对SIMD患者具有心脏保护作用。 第二部分 内源性硫化氢生成减少参与了脂多糖诱导的小鼠心脏功能障碍 目的：观察内源性H2S与SIMD小鼠心功能的关系。 方法：本部分实验采取C57BL/6J小鼠以及CSE knock-out（CSE KO）小鼠，给予腹腔注射LPS 10mg/kg复制SIMD动物模型。LPS后6h心脏超声观察LPS对小鼠心功能的影响，HE染色观察小鼠心肌组织形态学变化，检测小鼠血浆中心肌酶cTnI、CK浓度以及炎症因子TNF-α、IL-1β浓度，检测小鼠血浆以及心肌组织中H2S浓度，并且检测小鼠心肌组织中三种内源性H2S合成酶的活性以及蛋白表达水平。 结果： 1.与Control组相比，LPS组小鼠给予腹腔注射LPS 10mg/kg后6h超声心动图显示LVEF及LVFS明显下降，血浆cTnI、CK水平及TNF-α、IL-1β水平升高，并且心肌组织HE染色可见炎性改变。 2.与Control组相比，LPS组小鼠给予腹腔注射LPS 10mg/kg后6h血浆及心肌组织H2S水平明显降低。 3.与Control组相比，LPS组小鼠给予腹腔注射LPS 10mg/kg后6h心肌组织3-MST活性下降，心肌组织CSE、CBS和3-MST的蛋白表达均明显下降，而CSE＆CBS活性两组间无改变。 4.与WT+LPS组相比，CSE KO+LPS组小鼠LVEF及LVFS下降更明显，血浆cTnI、CK水平升高更明显，心肌组织炎性改变加重。 结论：小鼠给予LPS 10mg/kg腹腔注射后出现炎症因子升高、心脏超声指标下降、心肌酶升高以及心肌组织炎性改变，能够成功模拟临床上SIMD疾病模型。SIMD小鼠血浆及心肌组织H2S水平下降，同时伴随心肌组织3-MST活性下降以及CSE、CBS和3-MST蛋白表达降低。与WT小鼠相比，CSE 敲除小鼠给予 LPS 后心功能损伤加重，证实内源性 H2S减少参与了SIMD的病理生理过程，具有心脏保护作用。 第三部分 外源性硫化氢可减轻脂多糖诱导的小鼠心脏功能障碍 目的：观察外源性H2S与SIMD小鼠心功能的关系。 方法：本部分实验采取C57BL/6J小鼠以及CSE KO小鼠，给予腹腔注射LPS 10mg/kg复制SIMD动物模型，LPS后3h给予NaHS干预。LPS后6h心脏超声观察NaHS对小鼠心功能的影响，HE染色观察小鼠心肌组织形态学变化，检测小鼠血浆 cTnI、CK 浓度以及血浆、心肌组织中H2S水平。 结果： 1.与LPS组相比，LPS+10μmol/kg NaHS组小鼠心脏超声无明显改变，LVEF及LVFS无明显升高，而LPS+50μmol/kg NaHS组以及LPS+100μmol/kg NaHS组小鼠LVEF及LVFS均明显升高，但是LPS+100μmol/kg NaHS组小鼠LVEF及LVFS与LPS+50μmol/kg NaHS组小鼠相比无差异。因此，选择50μmol/kg NaHS的剂量用于之后的实验。 2.与Control组小鼠相比，LPS组小鼠给予腹腔注射LPS 10mg/kg 6h后LVEF及LVFS明显下降，血浆cTnI、CK浓度明显升高，心肌组织出现组织肿胀、炎症细胞浸润等改变，而给予50μmol/kg NaHS能够升高C57 LPS小鼠的LVEF和LVFS，降低其血浆cTnI、CK水平，减轻小鼠心肌组织形态学改变。 3.与Control组小鼠相比，LPS组小鼠给予腹腔注射LPS 10mg/kg后6h血浆及心肌组织中H2S水平明显降低，而给予50μmol/kg NaHS能够升高C57 LPS小鼠血浆及心肌组织中H2S水平。 4.与WT+LPS组相比，CSE KO+LPS组小鼠LVEF及LVFS明显降低，给予50μmol/kg NaHS不能改善CSE KO+LPS+NaHS组小鼠的LVEF及LVFS，加大NaHS剂量为100μmol/kg可改善CSE KO+LPS+NaHS组小鼠的LVEF及LVFS，因此，选择100μmol/kg NaHS的剂量用于之后的实验。 5.心脏超声结果显示，与WT+LPS组小鼠相比，CSE KO+LPS组小鼠给予腹腔注射LPS 10mg/kg后6h LVEF及LVFS下降更加明显，血浆cTnI、CK水平明显升高，心肌组织炎性改变加重，而给予100μmol/kg NaHS能够升高CSE KO+LPS组小鼠的LVEF和LVFS，降低CSEKO+LPS+ NaHS组小鼠血浆cTnI、CK水平，减轻CSE KO+LPS+NaHS组小鼠心肌组织形态学改变。 结论：外源性补充NaHS 50μmol/kg能够改善C57 LPS小鼠心功能，提高LVEF和LVFS，降低血浆cTnI、CK水平，减轻心肌组织炎性改变，并且增加C57 LPS小鼠血浆以及心肌组织中H2S水平，使其接近正常值。但是50μmol/kg NaHS不能改善CSE敲除LPS小鼠心脏超声指标，而100μmol/kg NaHS可以改善CSE敲除LPS小鼠心功能，提高LVEF和LVFS，降低血浆cTnI以及CK水平，减轻心肌组织炎性改变。证实外源性补充H2S可以改善SIMD小鼠心功能，具有心肌保护作用。 第四部分 硫化氢通过抑制 TLR4 减轻脂多糖所致炎症反应和内质网应激 目的：观察和探讨H2S保护SIMD小鼠心功能的机制 方法：本部分实验模型制备及分组同第三部分，检测小鼠血浆TNF-α、IL-1β浓度，检测心肌组织中TLR4以及ERS三条通路标志物的蛋白表达。 结果： 1.与Control组相比，LPS组小鼠给予腹腔注射LPS 10mg/kg后6h血浆TNF-α、IL-1β水平明显升高，给予50μmol/kg NaHS能够降低LPS+NaHS组小鼠血浆TNF-α、IL-1β水平，有统计学差异。 2.与Control组相比，LPS组小鼠给予腹腔注射LPS 10mg/kg后6h心脏组织TLR4蛋白表达明显升高，给予50μmol/kg NaHS能够降低LPS+NaHS组小鼠心脏组织TLR4蛋白表达，有统计学差异。 3.与Control组相比，LPS组小鼠给予腹腔注射LPS 10mg/kg后6h心脏组织CHOP、Caspase-12、PERK、pPERK、IRE、pIRE、p90ATF6、p50ATF6蛋白表达明显升高，给予50μmol/kg NaHS能够降低上述指标在心脏组织中的蛋白表达，有统计学差异，而GRP78蛋白表达三组间无明显改变。 4.与WT+LPS组相比，CSE KO+LPS组小鼠腹腔注射LPS 10mg/kg后6h血浆TNF-α、IL-1β水平升高更明显，给予100μmol/kg NaHS能够降低CSE KO+LPS+NaHS组小鼠血浆TNF-α、IL-1β水平，有统计学差异。 5.与WT+LPS组相比，CSE KO+LPS组小鼠腹腔注射LPS 10mg/kg后6h心脏组织TLR4蛋白表达更高，给予100μmol/kg NaHS能够降低CSE KO+LPS+NaHS组小鼠心脏组织TLR4蛋白表达，有统计学差异。 6.与WT+LPS组相比，CSE KO+LPS组小鼠给予腹腔注射LPS 10mg/kg后6h心脏组织CHOP、Caspase-12、PERK、pPERK、IRE、pIRE、p90ATF6、p50ATF6蛋白表达更高，给予100μmol/kg NaHS能够降低上述指标在心脏组织中的蛋白表达，有统计学差异，而GRP78蛋白表达三组间无明显改变。 结论：LPS能够上调TLR4以及ERS标志物CHOP、Caspase-12、PERK、pPERK、IRE、pIRE、p90ATF6和p50ATF6在C57小鼠心肌组织中的表达，升高C57小鼠血浆TNF-α、IL-1β水平，与WT小鼠相比，CSE敲除小鼠上述指标升高更明显，外源性补充NaHS 50μmol/kg、100μmol/kg可分别降低C57小鼠以及CSE 敲除小鼠TLR4及上述ERS标志物在心肌组织中的表达。证实外源性 H2S 可通过抑制 TLR4 减轻ERS，发挥其对SIMD的保护作用。 第五部分 硫化氢减轻脓毒症急性肾损伤 目的：观察H2S对脓毒症急性肾损伤肾功能的作用。 方法：本实验选取河北医科大学第四医院ICU 10例SA-AKI患者作为病例组(AKI 组)，匹配选取 10 例该院健康体检者作为对照组(Control组)。入选患者均已签署知情同意书。患者入组后即刻记录一般情况及生命体征，留取静脉血检测血浆 TNF-α、IL-1β 浓度和血肌酐(creatinine，Cre)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)浓度，并检测血浆H2S的含量，观察肾功能指标 Cre 以及 BUN 与血浆 H2S 是否相关。之后，采取C57BL/6J小鼠给予腹腔注射LPS 5mg/kg复制AKI模型，LPS后3h给予NaHS 50μmol/kg干预。注射LPS后6h检测小鼠血浆中TNF-α、IL-1β水平以及 Cre、BUN 水平，HE 染色观察小鼠肾脏组织形态学变化，检测小鼠血浆以及肾脏组织中H2S水平以及肾脏组织中三种H2S合成酶的活性和蛋白表达，观察LPS以及NaHS对小鼠肾功能的影响。 结果： 1.两组性别、年龄、体重无差异。AKI 患者存在明确的感染灶，其中4例为呼吸道感染，3例为腹腔感染，1例为泌尿系感染，2例为肠源性感染，均为格兰阴性细菌感染(2例鲍曼不动杆菌，2例铜绿假单胞菌，2 例肺炎克雷伯菌，3 例大肠埃希氏菌，1 例难辨梭菌)，既往均无肾脏病史，并排除肾性及肾后性因素。与 Control 组相比，AKI 组患者白细胞升高明显。此外，AKI组患者血浆Cre、BUN水平以及TNF-α、IL-1β水平均较Control组明显升高，说明AKI组患者符合诊断标准，且均由细菌感染引起。 2.与Control组相比，AKI组患者血浆中H2S的含量明显下降，并且H2S的含量与Cre、BUN均呈显著负相关。 3.与Control组相比，AKI组小鼠给予腹腔注射LPS 5mg/kg后6h血浆 Cre、BUN水平以及 TNF-α、IL-1β水平明显升高，肾脏组织出现肾小球萎缩、细胞空泡变性、肾小管扩张、管型形成、炎症细胞浸润等改变，肾脏损伤评分下降，AKI模型制备成功。同时可见血浆H2S及肾脏组织H2S水平下降，并伴随肾脏组织3-MST活性和蛋白表达下降。 4.给予50μmol/kg NaHS能够升高AKI组小鼠血浆及肾脏组织H2S水平，降低AKI组小鼠血浆Cre、BUN水平以及TNF-α、IL-1β水平，改善其肾脏组织形态学改变，升高肾脏损伤评分。 结论：临床实验中，AKI 患者表现为肾功能下降，血浆炎症因子TNF-α、IL-1β水平升高，血浆H2S水平下降，并且血浆H2S水平与肾功能指标Cre、BUN均呈负相关。小鼠给予LPS腹腔注射能够成功模拟临床上AKI模型，AKI小鼠血浆及肾脏组织H2S水平下降，同时伴随肾脏组织 3-MST 活性以及蛋白表达下降，证实内源性 H2S减少参与了 LPS所致AKI的发病过程。NaHS能够升高AKI小鼠血浆及肾脏组织H2S水平，降低血浆 TNF-α、IL-1β以及 Cre、BUN水平，减轻肾脏组织形态学改变，证明H2S可以通过降低炎症反应从而改善LPS引起的肾脏损伤。
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