摘要
弓形虫是专性细胞内寄生原虫，可感染几乎所有的温血动物和全世界将近三分之一的人口。作为机会性致病寄生虫，弓形虫感染健康的个体一般不表现出明显的临床症状，但对免疫功能缺陷的个体危害极大。在养殖业中，弓形虫感染常导致家畜的流产与死胎等，由于弓形虫本身复杂的生活史和广泛的宿主范围，同时伴随着我国养殖业发展的规模化和集约化，弓形虫病带来的经济损失和公共安全问题日益突出。因此现阶段如何预防治疗弓形虫病成为了我国乃至世界研究的重点和难点。目前市面上弓形虫病的治疗药物稀少，副作用强，且只对急性感染期的弓形虫有效，尚无慢性感染的治疗药物。疫苗是预防控制弓形虫感染的有效途径，但目前尚没有安全可靠的理想疫苗产品。 弓形虫尿苷酸(UMP)的合成包括两条途径：从头合成途径和补救合成途径，其中从头途径是合成UMP的主要途径，因为正常条件下补救途径合成的UMP不能满足弓形虫复制的需要。乳清酸磷酸核糖转移酶(OPRT)、乳清苷-5’-单磷酸盐脱羧酶(OMPDC)两个基因编码弓形虫UMP从头合成途径中的最后两个酶。乳清酸是弓形虫嘧啶从头合成途径中合成的嘧啶衍生物，它在OPRT的作用下从嘌呤核苷酸从头合成的中间产物磷酸核糖焦磷酸(PRPP)中获得磷酸核糖生成乳清酸核苷酸(OMP)，OMP在OMPDC的作用下脱羧后形成UMP。乳酸脱氢酶(LDHs)催化丙酮酸和乳酸之间的相互转化，弓形虫编码两个LDHs，而乳酸脱氢酶1(LDH1)对生理条件下弓形虫的复制和生存有着至关重要的作用。本课题从嘧啶合成通路和糖酵解通路着手构建弓形虫营养缺陷弱毒虫株。利用同源重组的方法，构建了靶向oprt、ompdc基因的CRISPR质粒和同源模板质粒，利用CRISPR/Cas9技术分别敲除了嘧啶合成通路上的oprt、ompdc两个基因，构建了两个单基因敲除的营养缺陷虫株Δoprt和Δompdc，并且用pmin-Cre-eGFP质粒成功删除了外源性插入的DHFR*药物筛选标签；在得到的Δoprt、Δompdc虫株的基础上敲除糖酵解途径的乳酸脱氢酶1基因(ldh1)，构建了ΔoprtΔldh1、ΔompdcΔldh1虫株。随后把构建的营养缺陷弱毒虫株Δoprt、Δompdc、ΔoprtΔldh1、ΔompdcΔldh1按速殖子剂量为1×104/只接种KM鼠，观察其存活情况。我们的研究发现营养缺陷虫株在小鼠体内毒力大幅度下降，其中Δompdc、ΔompdcΔldh1虫株对小鼠基本无毒力。对已感染营养缺陷虫株的KM小鼠再次接种ME49野生虫株速殖子(1×104/只)后，小鼠均存活且没有明显症状。在免疫缺陷小鼠的毒力试验中，与野生虫株感染相比，Δompdc、ΔompdcΔldh1虫株感染免疫缺陷小鼠其存活时间明显延长，且双敲虫株接种的缺陷小鼠具有更长的存活时间。采集感染小鼠血清，进行MIC3-ELISA检测，抗体均为阳性，对脑组织进行DBA-FITC染色观察无明显脑包囊的形成，说明该过程未造成慢性感染。最后我们用定量PCR检测了营养缺陷突变虫株在小鼠体内的繁殖情况：小鼠在腹腔接种ME49虫株(104/只)后的第8d，腹水荷虫量达到了107，然而接种Δoprt、ΔoprtΔldh1虫株的小鼠体内荷虫量仅有几千个，并且接种Δoprt虫株的小鼠体内荷虫量多于接种ΔoprtΔldh1虫株的小鼠；接种Δompdc、ΔompdcΔldh1虫株的小鼠，体内荷虫量只有几十个，已经低于定量PCR的敏感性下限。荷虫量的试验结果与动物毒力试验结果相符合。 从试验结果中可知，本课题构建的营养缺陷型减毒虫株可为宿主提供抵抗弓形虫感染的免疫保护力，ΔompdcΔldh1虫株的效果最优，可作为弓形虫防控的候选疫苗。
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