摘要
发育柿果存在一种特化的果肉细胞--“单宁细胞”，其液胞中积累大量原花青素(Proanthocyanidins，PAs；俗称“柿单宁”)，是呈现涩感的主要原因。已有研究表明，原花青素前体在液胞中聚合为高分子柿单宁，漆酶（Laccase）可能参与该聚合反应，但是否有靶定漆酶基因的miRNA参与到柿原花青素聚合过程却未见报道。本试验以中国甜柿‘鄂柿1号’、日本甜柿‘阳丰’、非完全甜柿‘磨盘柿’为试材，利用已有数据库筛选克隆出柿漆酶基因家族成员DkLAC2和柿DkmiR397前体序列，并对其在中国甜柿原花青素前体聚合中的作用及其相互关系进行探讨，以期为柿单宁代谢调控的分子机理研究提供科学依据。主要结果如下： （1）基于中国甜柿转录组数据库和miRNA文库，在全基因组范围内筛选分离出可能参与柿单宁代谢的DkmiR397前体序列和靶基因DkLAC2全长序列。聚类分析发现，候选靶基因DkLAC2与拟南芥漆酶家族中具有促进种皮原花青素聚合功能的AtLAC15聚为一类，表明其可能有促进原花青素生物合成的功能。 （2）实时荧光定量PCR分析证明DkmiR397与DkLAC2在中国甜柿果实发育过程中的表达量呈负相关。 （3）激光共聚焦显微观察结果显示DkLAC2定位于液泡膜内，与DkLAC2在液泡内促进原花青素前体聚合的功能相符。 （4）应用RLM-5’RACE试验证明DkmiR397对DkLAC2的靶切位点在与两者互补序列的5’端第10个核苷酸处，通过农杆菌介导的烟草共转化表达进行GUS组织化学染色试验和双荧光素酶试验分别从定性和定量角度证明DkmiR397对DkLAC2确有靶切作用。 （5）分别构建DkmiR397和DkLAC2超表达和干涉载体，通过农杆菌注射渗透介导的柿活体叶片瞬时转化体系，当瞬时超表达DkLAC2后，单宁含量显著上升，与原花青素代谢相关结构基因表达量均显著上升，瞬时干涉后结果与之相反；当瞬时超表达DkmiR397后，单宁含量显著降低，与原花青素代谢相关结构基因表达量均显著降低，瞬时干涉后结果与之相反。 综上所述，确认DkmiR397通过沉默DkLAC2从而负调控原花青素前体的聚合过程，该结果为构建中国甜柿原花青素合成调控网络提供了科学依据。
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