摘要
CRISPR/Cas9系统作为最新的基因组编辑技术，以其高效、简便、灵活、成本低的优点成为作物遗传改良和新品种培育的重要手段。利用CRISPR/Cas9系统定向提升番茄品质，结合常规育种技术培育高品质的番茄新品种，已经成为番茄育种的重要研究方向。本实验分别以栽培番茄品种（系）AilsaCraig（AC）、B5和B9为试材利用CRISPR/Cas9双元表达载体系统，对番茄品质基因SlGLK2和SlMYB12进行定点基因编辑，对T0代转基因番茄植株的表型和对应目标基因的编辑情况进行了鉴定和分析，主要结果如下： 1、分别在SlGLK2和SlMYB12基因的第一个外显子上设计了2个靶点，构建了它们CRISPR/Cas9双元表达载体，利用农杆菌介导法获得转基因番茄植株。获得AC背景下SlGLK2和SlMYB12的CRISPR/Cas9转基因植株各9株，获得B5背景下SlGLK2的CRISPR/Cas9转基因植株3株，获得B9背景下SlMYB12的CRISPR/Cas9转基因植株4株，且PCR检测结果阳性率均为100%。 2、通过PCR产物连接载体测序统计编辑效率发现，CRISPR/Cas9载体的编辑效率在25%-100%之间。SlGLK2在AC和B5背景下编辑效率均为100%，SlMYB12在AC和B9背景下编辑效率为25%-88.9%；CRISPR/Cas9载体在同一品种下编辑不同基因的编辑效率不同，SlGLK2-AC的编辑效率达100%，SlMYB12-AC有88.9%。 3、对SlGLK2和SlMYB12的T0代转基因植株进行测序分析，发现这些编辑的靶位点在PAM上游3-4bp处发生了不同形式的碱基缺失、插入和替换，主要以1-10bp的缺失和单碱基G和T的插入为主。此外运用CRISPR/Cas9双元表达载体还可以产生两靶点间的大片段缺失，缺失的最大片段为334bp。 4、SlGLK2在AC背景下的T0代单株中，并未产生无“青肩”单株，但是与对照AC相比，这些转基因植株果实肩部的绿色明显变浅，而在B5背景下的三株转基因番茄均无“青肩”；SlMYB12在AC背景下产生一株粉果材料。为了得到稳定表型的纯合突变体，还需要在T1代中进行自交分离。 综上所述，本研究成功创制了SlGLK2和SlMYB12品质基因的突变体，其中在栽培品种AilsaCraig背景下产生一株粉果突变体，在B5背景下产生三株无“青肩”突变体。该研究结果为番茄品质育种提供了宝贵的育种材料。
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