摘要
花粉萌发和花粉管生长是有花植物有性生殖所必需的生理活动.在此过程中,高度动态和精准调控的微丝骨架起着决定性的作用.微丝束对花粉管生长过程中胞质环流和细胞器运动是至关重要的.微丝成束是由多种微丝成束/交联蛋白调控的.然而,目前对于高度有序的微丝骨架在植物中的形成机制仍不清楚.因此,鉴定和研究植物特异的微丝结合蛋白对于揭示植物微丝骨架的调节机制具有非常重要的意义.在本文中,我们首次报道了一个新的植物特异微丝交联蛋白家族(CROLIN),并选择其中花粉特异表达成员-CROLIN1进行生理和生化的功能分析,取得的主要成果如下: 1,利用生物信息学的方法,在TAIR数据库中发现了一个含有微丝交联结构域的功能未知蛋白家族(InterPro:IPR008999).利用PhyreServer数据库对预测的交联结构域进行了结构分析,发现含有该功能结构域的蛋白还有动物中的fascin和盘基网柄菌中的hisactophilin.然而它们之间的氨基酸同源性仅为16%,说明CROLIN有可能是一种新的植物特异微丝交联蛋白家族. 2,构建了AtCROLIN1启动子-GUS载体,利用GUS报告基因鉴定了CROLIN1的组织定位.GUS活性检测结果表明,CROLIN1特异地在花粉中进行表达.此外,通过RT-PCR实验也得到了相同的实验结果,CROLIN1只在花和花苞中表达. 3,利用高速共沉淀的方法证明了CROLIN1在体外具有结合微丝的能力且亲和力较高,Kd值高达0.324μM.另外,利用低速共沉淀的方法证明CROLIN1在体外具有促进微丝成束的能力. 4,利用荧光显微镜和电子显微镜对CROLIN1的微丝成束机制进行了分析,结果表明CROLIN1不仅能够促使微丝成束同时能够促进微丝形成更高级的细胞骨架结构.利用醋酸铀染色观察发现大量的交联结构出现致使微丝形成网络状结构,微丝间cross-bridge的距离为4nm.此外,利用微丝解聚药物LatB和微丝剪切蛋白ADF1证明CROLIN1能够在体外稳定微丝. 5,为了对CROLIN1进行体内生理功能研究,试验中筛选了T-DNA插入突变体(crolin1)、RNAi株系和过表达株系.研究发现,T-DNA插入突变体以及RNAi株系与野生型相比对微丝解聚药物LatB更加敏感.主要表现为:用药物处理后与野生型相比花粉萌发率降低、生长速率减慢并出现较高的畸形比率.然而,在过表达株系中得到相反的结果,花粉管内微丝比野生型更加稳定.说明体内CROLIN1能够稳定微丝. 综上所述,本研究利用生化、遗传学、分子生物学和细胞生物学等方法充分证明了AtCROLIN1是一个新的、植物中特异表达的微丝成束/交联蛋白,在体内和体外都可以稳定微丝.CROLIN1有可能通过调控高级形态的微丝结构形成参与花粉萌发和花粉管的极性生长.
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