摘要
微孢子虫（microsporidia）是一类胞内寄生的单细胞真核病原菌，家蚕微孢子虫（Nosemabombycis）能引起家蚕微粒子病，并且给世界各国蚕丝业带来了毁灭性的危害。自发现家蚕微孢子虫以来，其研究历史已有一百多年，但是由于缺乏有效的遗传操作手段，极大的限制了对其致病机理及垂直传播机制的进一步了解。近年来随着转基因技术的发展，CRISPR/Cas9等基因编辑技术和位点特异性重组酶技术被开发出来并广泛应用于多种领域，实现了对多种生物基因组的定向修饰，同时也给家蚕微孢子虫的基因操作带来了希望。因此，本研究旨在以CRISPR/Cas9技术和φC31整合酶介导的位点特异性重组技术为基础，通过探索多种外源基因的转化方法和筛选富集技术建立家蚕微孢子虫的遗传操作体系，为其基因功能研究提供新方法。主要研究结果如下： 1.家蚕微孢子虫转基因载体的构建及外源基因转化方法的探索 本研究选择家蚕微孢子虫serpin14基因作为其靶位点。通过分子生物学手段，成功构建了家蚕微孢子虫serpin14基因的敲除载体pKOspn14，其主要包括U6启动子驱动gRNA的表达盒、携带靶位点上下游约1kb同源臂的由家蚕核型多角体病毒（BmNPV）IE1启动子调控的绿色荧光蛋白EGFP的报告基因表达盒。同时也构建了一个基于φC31整合酶系统的转基因载体pINT-EGFP，其主要包括报告基因egfp的表达盒和φC31-Int的表达盒及其识别位点。接着，我们利用基因枪转化和脂质体转染的方法将转基因载体导入家蚕微孢子虫成熟孢子中或被感染的家蚕BmE细胞中，对不同的转化方法进行了探索。结果表明，通过脂质体转染10天后仍能观察到了带有荧光标记的家蚕微孢子虫，但荧光信号较弱，而基因枪转化法并未观察到，证明脂质体转染法可以将载体有效的转入家蚕微孢子虫体内。 2.家蚕微孢子虫转基因载体元件的优化 为了增强转基因载体报告基因的荧光强度，便于后续显微观察和流式细胞仪分选，根据实验室前期所得的家蚕微孢子虫侵染家蚕中肠早期的转录组数据，通过qPCR筛选出了三个表达量相对较高的基因，并分别克隆其上游启动子序列用于调控报告基因的表达，之后通过脂质体转染将载体导入受体中，结果显示，所选三个基因的启动子并未增加报告基因的荧光强度，有待进一步筛选其他适用的强启动子；同时基于φC31整合酶系统，对转基因载体的报告基因EGFP和φC31整合酶均进行了密码子优化，但转染后其荧光信号也未增强。 3.转基因家蚕微孢子虫筛选体系的建立 为了便于转基因家蚕微孢子虫的筛选富集，本研究探索了两种富集纯化方法。第一种为免疫亲和纯化，预期通过构建孢壁蛋白融合表达荧光蛋白的转基因家蚕微孢子虫，利用亲和纯化的方法富集转基因家蚕微孢子虫。在该研究中利用CRISPR/Cas9系统成功构建了家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP30和EGFP融合表达的转基因载体pKIswp30e，通过脂质体转染宿主2天后观察到了带有荧光标记的家蚕微孢子虫，但荧光信号并未聚集在家蚕微孢子虫孢壁表面，而是分布于孢子内部，连续培养后，未检测到荧光信号。第二种方法为抗生素筛选法，预期对导入抗性基因的家蚕微孢子虫进行抗性筛选来富集转基因家蚕微孢子虫。在该研究中首先选择了多种具有相应抗性基因的抗生素，并设计不同浓度梯度对它们的家蚕细胞毒性与抑制家蚕微孢子虫增殖的能力进行了评估，最终研究表明多菌灵对家蚕细胞毒性较小，且对家蚕微孢子虫的增殖具有较好的抑制效果，并结合φC31整合酶系统成功构建了基于多菌灵抗性基因BenR的转基因载体，用于转染后抗生素筛选。
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