摘要
本文主要从以下几部分进行论述： 第一章 全基因组测序在复发性流产人群中对染色体异常病因的扩大诊断 复发性流产(recurrent pregnancy loss，RPL)是常见的产科并发症，约影响1％的育龄女性。RPL病因复杂，遗传因素、抗磷脂抗体综合征和子宫解剖结构异常是明确的致病原因，感染、自身免疫因素、内分泌或代谢异常比如糖尿病或甲状腺疾病等病因虽与流产相关，但与RPL的关系不甚明确。排除这些因素，约50％的RPL病人经检测无异常，称为不明原因复发性流产(unexplained RPL，uRPL)。因uRPL人群病因不明确，只能提供经验治疗，但无法获得满意的治疗效果。外周血G显带是染色体核型分析的金标准，约5％的RPL夫妇中至少一方的染色体为异常，常染色体相互易位是最常见的染色体异常，其次为罗伯逊易位和倒位。染色体异常的RPL人群可以通过植入前遗传学检测筛选正常/平衡胚胎，以获得活产结局。但是目前G显带分辨率为320-400条带，存在分辨率较低的缺点，若能够在RPL人群中增加诊断精度，进一步获得明确病因的诊断，则RPL病人能够直接临床受益。有文章显示，全基因组测序(whole-genome sequencing，WGS)有分辨率高的特点，能够额外检测出常规显带染色体分析未发现的染色体异常。 目的:应用一项经过验证的低深度WGS，对uRPL病人的外周血DNA进行测序分析，以期检测出常规G显带核型分析未发现的染色体异常，进一步扩大诊断RPL人群中染色体异常的发生率。 方法:共纳入1024对uRPL夫妇应用WGS进行外周血DNA测序，纳入标准为:发生2次或以上孕早期临床妊娠自然流产，夫妇双方外周血常规G显带无异常，女方无解剖结构异常，无抗磷脂抗体综合征或自身抗体阳性，无内分泌异常或代谢性疾病。测序发现的平衡易位或倒位，应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)和Sanger测序验证断裂位点，同时收集病人的新鲜外周血进行高分辨显带和荧光原位杂交(fluorescence in-situ hybridization，FISH)确认衍生染色体;对测序发现的拷贝数变异(copy number variants，CNVs)应用染色体微阵列分析芯片(chromosomal microarray analysis，CMA)进行验证。 结果:1024对夫妇的2048份外周血DNA样本，13份没有通过质量控制，因此1011对(98.7％) uRPL夫妇纳入最终WGS结果分析。测序结果显示，48对(4.75％)夫妇中发现了额外的49例染色体重排，包括22例平衡易位和27例倒位。在22例平衡易位中，14例在初始显带核型或高分辨显带中得到确认，8例易位因为交换片段隐匿或衍生染色体与正常染色体带型类似而不能在显带核型中得到确认;27例倒位中，4例在显带核型中得到确认，剩余23例因片段隐匿或倒位片段低于显带分辨率而不能通过G显带检测。WGS报告的染色体重排均通过PCR和Sanger测序得到验证，部分异常通过FISH进一步确认。另外，WGS检测出1例致病CNV和5例可能致病CNVs，均通过CMA技术得到验证。 结论:WGS能够检测出常规G显带核型分析无法检测出的染色体异常，推荐将WGS应用于RPL病人病因学筛查中，以提高染色体异常病因检出率，为后续治疗提供临床指导。 第二章 染色体易位对减数分裂模式的影响 第一节 易位涉及近端着丝粒染色体与携带者性别相互作用影响常染色体相互易位的减数分裂模式 相互易位是一种常见的染色体结构异常，指的是两条非同源染色体分别发生一次断裂，断裂片段相互交换后重接，形成两条衍生染色体，在普通人群中的发生率为0.74-1.25例每1000新生儿，在复发性流产人群中发生率约为2.4％。在配子形成过程中，减数分裂Ⅰ的前期，两条衍生染色体和相应的两条正常染色体形成四射体，在Ⅱ的后期，四射体有对位、邻位-1、邻位-2、3∶1、4∶0这几类分离模式，其中只有对位分离模式才能产生染色体正常或平衡的配子，其他分离模式产生的配子均含有不平衡染色体结构异常。由于这些染色体不平衡配子的产生，相互易位携带者会面临一系列生育相关问题，包括不孕，流产，新生儿先天畸形等。已有研究表明，四射体的分离模式受到一些比如携带者性别、年龄和涉及染色体类型等因素的影响，但是在所有的报道中，受到明显影响的是邻位-1、邻位-2、3∶0这些产生染色体不平衡配子的分离模式，只有一项研究显示产生染色体正常或平衡配子的对位分离模式受到明显影响，同时，影响四射体分离的这些因素之间是否有相互作用不清楚。 目的:探究相互易位携带者性别与易位涉及染色体类型之间是否相互作用，影响四射体的分离模式。 方法:回顾性分析在我院行植入前遗传学检测(preimplantation genetic testingfor structural rearrangement，PGT-SR)的相互易位携带者的囊胚结果。在2013年1月至2016年9月共473对夫妇通过PGT-SR助孕，包括243例女性相互易位携带者（76例易位涉及近端着丝粒染色体）和230例男性携带者(88例易位涉及近端着丝粒染色体)，活检的滋养外胚层细胞应用基于微阵列芯片的比较基因组杂交技术检测细胞团的染色体组成，根据易位涉及染色体类型、携带者性别和年龄分析四射体的分离模式和囊胚的整倍体率。 结果:本次研究共分析了2101枚囊胚的四射体分离模式。在涉及近端着丝粒染色体的相互易位亚组中，男性携带者产生的对位分离模式比例(53.9 vs33.4％，P＜0.0001)明显高于女性携带者，同时3∶1分离模式(6.8 vs16.3％，P＜0.0001)比例明显降低。在易位未涉及近端着丝粒染色体亚组中，男性携带者的四射体分离模式与女性携带者相似。同时，在女性携带者亚组中，若易位涉及近端着丝粒染色体，与未涉及近端着丝粒染色体的易位相比，对位分离的模式明显减少(33.4 vs45.2％，P＜0.001)且3∶1分离模式明显增加(16.3 vs8.2％，P＜0.001);在男性携带者亚组中，与未涉及近端着丝粒染色体的易位相比，对位分离模式比例(53.9 vs46.9％，P=0.031)在涉及近端着丝粒染色体的易位中增加，同时邻位-1分离模式明显减少(27.1 vs37.3％，P＜0.001)。易位携带者的性别不影响四射体的分离模式。囊胚的整倍体率与女性年龄相关，高龄女性囊胚整倍体率明显低于年轻女性。 结论:在常染色体相互易位减数分裂过程中，易位涉及近端着丝粒染色体与携带者性别相互作用影响四射体的对位分离模式比例，进而影响染色体正常或平衡配子的产生。这项研究的发现可以为相互易位携带者提供更详细的遗传咨询，明确其能产生整倍体配子的可能性。 第二节 携带者性别和年龄对罗伯逊易位减数分裂模式的影响 罗伯逊易位由两条近端着丝粒染色体发生着丝粒融合形成，其发生率在普通人群为0.74-1.23例每1000新生儿，在复发性流产患者中为3.1％。在减数分裂Ⅱ前期，新形成的一条衍生染色体与相应的两条正常近端着丝粒染色体形成三价体，在Ⅱ后期，三价体按照以下模式进行分离:对位、邻位和3∶0分离，其中只有对位分离才能形成染色体正常或平衡配子。若罗伯逊易位涉及13号或21号染色体，则有可能生育13-三体综合征或者21-三体综合征的新生儿，所以对罗伯逊易位携带者在生育前进行遗传咨询非常有必要。在上一节中，我们发现在涉及近端着丝粒染色体的常染色体相互易位中，不同携带者性别之间减数分离模式存在显著差异，而这种差异在未涉及近端着丝粒染色体的相互易位中不存在。 目的:分析携带者的年龄与性别是否影响三价体的分离模式，探究罗伯逊易位的减数分离模式是否与相互易位相同。 方法:回顾性分析在我院行PGT-SR助孕的罗伯逊易位携带者囊胚检测结果。在2013年1月至2017年7月共154对罗伯逊易位夫妇通过PGT-SR助孕，包括77例女性携带者和77例男性携带者。活检的滋养外胚层细胞应用基于微阵列芯片的比较基因组杂交技术检测细胞团的染色体组成，根据携带者性别和年龄分析三价体的分离模式，并根据女性年龄分析囊胚的整倍体率。 结果:604枚囊胚结果纳入分析。与女性罗伯逊易位携带者相比，男性携带者中对位分离的比例(82.9 vs55.2％，P＜0.001)明显增加，邻位分离的比例(16.8 vs42.6％，P＜0.001)明显减少，而3∶0分离模式的比例没有区别。根据易位涉及染色体分析，在同一携带者性别中，三价体的分离模式是相似的。携带者的年龄对三价体的分离模式没有影响。囊胚的非整倍体率与女性年龄相关，高龄女性的囊胚非整倍体率明显高于年轻女性，且与易位未涉及的其他染色体的新发异常有关，尤其是整条染色体异常。 结论:与涉及近端着丝粒染色体的相互易位的分离模式相似，在罗伯逊易位中，男性携带者产生染色体正常或平衡配子的对位分离模式的比例明显高于女性携带者，且三价体的分离模式与携带者的性别无关。这两项研究的联合分析可以为理解染色体易位在不同携带者性别之间的分离模式提供帮助，进而评估携带者的生育风险和进行适当的遗传咨询。
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