摘要
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，据2018年最新统计结果显示，乳腺癌发病率和死亡率均位居女性恶性肿瘤之首，严重影响女性健康。乳腺癌的发生发展与雌激素的代谢异常密切相关。根据经典雌激素受体ER-α的表达情况，可将乳腺癌分为雌激素受体（Estrogen receptor，ER）阳性和ER阴性两种类型。他莫昔芬（tamoxifen，TAM）作为首选的ER阳性乳腺癌内分泌治疗药物，主要通过与雌激素竞争性结合ER而发挥肿瘤抑制作用。但是接受TAM治疗的乳腺癌患者中有40％-50％对TAM有原发性耐药，而在TAM治疗过程中又有17％-28％的患者产生继发性耐药。TAM耐药严重影响其临床治疗效果，是目前乳腺癌内分泌治疗面临的一大难题。 雌激素受体ER-α36是一种新型雌激素受体，它作为膜受体通过配体或非配体依赖方式活化细胞膜信号，进一步激活PI3K/AKT、MAPK/ERK等信号通路，影响细胞的增殖、迁移和凋亡等行为。临床上发现乳腺癌TAM耐药与ER-α36高表达相关，ER-α36高表达的乳腺癌患者TAM治疗效果差，基础研究已证实ER-α36与HER2/EGFR之间的正反馈调节环路的激活是导致乳腺癌TAM耐药的重要机制之一，但是到目前为止，ER-α36表达上调机制尚未见报道。 CUL4B属于Cullin(CUL)家族，作为骨架蛋白参与构成真核生物中最大的一类E3连接酶家族Cullin-Ring泛素E3连接酶复合物。近年来多项研究表明，CUL4B在肿瘤发生发展中扮演重要角色，可以通过表观遗传学机制影响多种肿瘤的发生、增殖、迁移等行为。已经明确CUL4B可以通过抑制miR-125a上调HER2表达并影响胃癌细胞的侵袭和上皮-间质转化，而乳腺癌中ER-α36和HER2之间的调控环路与乳腺癌TAM耐药之间反馈调节关系也已被证实。我们推测CUL4B可能通过调节ER-α36参与乳腺癌TAM耐药。因此，本课题分析了CUL4B与乳腺癌TAM耐药的相关性，及其调控TAM耐药的分子机制。 目的： 检测CUL4B在乳腺癌耐药和敏感细胞株中的表达情况;检测改变CUL4B表达水平（高表达及敲低）后乳腺癌细胞对TAM敏感性的影响;明确CUL4B调控TAM耐药是否是通过调控ER-α36的表达实现的？明确CUL4B对ER-α36的调控机制。 方法： 采用MTT方法检测细胞对TAM的敏感性;采用qRT-PCR和Western blot方法检测相关基因和蛋白表达情况;利用TargetScan等软件结合芯片检测结果确定调控ER-α36的若干候选miRNA;利用ChIP和qChIP分析CUL4B复合物及其相关蛋白在启动子区域结合情况。 结果： (1)CUL4B表达水平与乳腺癌细胞TAM耐药相关。为分析CUL4B在乳腺癌细胞TAM耐药中的作用，我们首先检测了CUL4B在5种乳腺癌细胞中的表达情况及这些细胞对TAM的敏感性，发现CUL4B高表达的MDA-MB-231、MDA-MB-436和BT474对TAM的IC50显著高于CUL4B表达较低的MCF7和T47D细胞;对比分析MCF7和T47D细胞与其对应耐药株发现，CUL4B在耐药株的表达水平显著高于对照细胞;通过改变细胞中CUL4B表达水平，我们发现过表达CUL4B显著减少TAM敏感性，而敲低CUL4B提高TAM敏感性。以上结果说明CUL4B参与调控乳腺癌细胞TAM耐药。 (2)CUL4B与ER-α36表达水平呈正相关。为明确CUL4B参与调控TAM耐药是否是通过调控ER-α36介导的，我们首先分析了这两种蛋白在不同细胞中的表达情况，发现两者的表达水平呈正相关;分析乳腺癌患者组织标本也证实两者的表达水平呈正相关。 (3)CUL4B复合物抑制miR-32-5p转录。为分析CUL4B调控ER-α36的机制，我们采用软件分析结合芯片结果分析，筛选出了可能调控ER-α36的miRNA，Real-time PCR分析显示CUL4B负调控miR-32-5p转录;ChIP分析显示CUL4B可以结合在miR-32-5p启动子区域，qChIP分析证实敲低CUL4B不仅减少CUL4B在启动子区域结合，而且也显著减少其催化产物H2AK119ub1以及EZH2、H3K27me3的结合，而增加H3K4me3的结合。进一步证实CUL4B复合物通过表观遗传学机制抑制miR-32-5p转录。 (4)miR-32-5p调控ER-α36表达。为证实miR-32-5p对ER-α36的调控作用，我们分析了抑制或增加miR-32-5p表达对ER-α36表达水平的影响，发现miR-32-5p mimics处理细胞导致ER-α36表达下调，而转染miR-32-5p inhibitor则引起ER-α36表达上调。利用报告基因系统分析显示，改变miR-32-5p表达能影响野生型报告基因表达，而不改变突变型报告基因表达。进一步证实miR-32-5p调控乳腺癌细胞ER-α36表达。 (5)CUL4B复合物通过负调控miR-32-5p表达进而促进ER-α36表达。为了分析CUL4B调控ER-α36是否是通过miR-32-5p介导的，我们分析了miR-32-5pmimics对过表达CUL4B引起的ER-α36上调的影响，发现miR-32-5p mimics能拯救由于CUL4B过表达引起的ER-α36上调;相反，miR-32-5p inhibitor可以恢复由于CUL4B下调而引起的ER-α36表达下调。临床样本检测结果显示CUL4B与ER-α36表达改变呈正相关，CUL4B与miR-32-5p，ER-α36与miR-32-5p的表达改变呈负相关。这些结果进一步支持CUL4B通过调控miR-32-5p进而调控ER-α36表达。 结论： 本研究发现CUL4B参与调控乳腺癌细胞TAM耐药;机制研究显示CUL4B通过转录抑制miR-32-5p表达进而促进ER-α36表达。
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