摘要
目的: 近年来，世界上糖尿病(diabetes mellitus，DM)患病率急剧上升，DM对人类的生命健康造成了严重威胁，其中引起糖尿病患者死亡的主要原因之一是心血管并发症。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病心血管并发症中公认的一种独立、特异的心肌病，与糖尿病患者发生心力衰竭和死亡率升高紧密相关。心肌纤维化(myocardial fibrosis，MF)又是DCM的主要病理改变之一，心肌成纤维胞的过度增殖以及基质蛋白和胶原纤维大量合成是导致MF的主要原因。本课题通过检测1型糖尿病(type1diabetes mellitus，T1DM)大鼠心肌组织中F框/WD-40域蛋白(F-box/WDrepeat-containing protein7，FBXW7)和RhoA/Rho激酶信号通路的变化，并通过慢病毒转染人心肌成纤维细胞（Human cardiac fibroblast，HCFB），进一步测定在高糖培养的HCFB细胞中干预FBXW7表达对RhoA/Rho激酶信号通路的影响，明确FBXW7通过RhoA/Rho激酶信号通路调控MF发生发展的作用机制，以期为DCM的治疗提供新的理论依据。 方法: 1.动物实验 1.1T1DM大鼠模型的建立 113只健康雄性SD大鼠适应性喂养1周后，按体重均衡的原则随机分为非糖尿病组（non-diabetic，ND组）40只，糖尿病模型组(diabetes mellitus model，DM组)73只。造模前禁食不禁水16h，DM组大鼠按60mg/kg的剂量一次性腹腔注射1％链脲佐菌素溶液进行造模，ND组正常大鼠腹腔注射同体积柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液。72h后所有大鼠禁食不禁水5～6h，尾静脉采血检测空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)值，以FBG＞16.7mmol·L-1，并出现多饮、多食、多尿和体重下降者为DM模型成功者，本次实验造模成功56只。 1.2FBXW7及RhoA/Rho激酶信号通路与糖尿病大鼠心肌纤维化的关系研究 将ND组正常大鼠随机分为2、4、8、12和16周空白对照组，每组8只;DM组造模成功大鼠随机分为2、4、8、12和16周模型组，每组分别为8只、9只、9只、13只、17只。ND组及DM组均以标准颗粒饲料和蒸馏水继续饲养。 各组大鼠分别于指定周期进行麻醉固定，腹主动脉取血5～10mL，3000r/min，离心10min，取上清分装。迅速取出心脏，分离左心，HE染色观察各组大鼠心肌组织病理变化，Masson染色及羟脯氨酸(HYP)检测心肌胶原沉积程度;ELISA法检测血清中FBXW7、转化生长因子β1(TGF-β1)和结缔组织生长因子(CTGF)的含量;测定各组血清中超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)的含量;Western蛋白印迹和免疫组化法检测心肌中FBXW7，RhoA和ROCK1蛋白的表达变化。 2.细胞实验 2.1细胞转染慢病毒及分组 先将处于对数生长期且生长状态良好的HCFB细胞分为低糖组（5.5mmol/L葡萄糖浓度）和高糖组（25mmol/L葡萄糖浓度）。再将高糖组细胞进行慢病毒转染，分为FBXW7过表达空病毒组、FBXW7过表达组、FBXW7干扰空病毒组和FBXW7干扰组。 2.2干预FBXW7表达对RhoA/Rho激酶信号通路及相关蛋白的影响 QRT-PCR检测细胞内FBXW7、RhoA和ROCK1mRNA水平;Western blotting检测细胞内FBXW7、RhoA和ROCK1蛋白的表达;碱水解法检测细胞内HYP含量;Elisa法检测细胞内TGF-β1、CTGF含量;按试剂盒说明检测细胞内SOD、MDA含量。 结果: 1.动物实验 1.1糖尿病大鼠一般状况 实验期间，正常对照组大鼠一般状态良好、健壮、皮毛有光泽，自主活动正常，对外界反应灵敏，无死亡。模型组大鼠逐渐出现多饮、多食、多尿和消瘦，精神萎靡，皮毛黯淡无光泽，腥臊酮臭味加重等症状，且随着时间延长，多饮、多食、多尿和消瘦表现加重，18只大鼠出现晶体变白，一般状况越来越差，造模成功56只，死亡5只。 随着糖尿病进程延长，ND组大鼠体重明显增加，FBG正常。与ND组相比，DM组大鼠体重、心脏及左心室重量明显低于ND组(P＜0.01)，FBG明显升高(P＜0.01);此外，与ND组相比，DM组2周、4周大鼠心脏指数和左心室指数变化不大(P＞0.05)，但8周、12周和16周大鼠均显著高于ND组（P＜0.01）。 1.2FBXW7及RhoA/Rho激酶信号通路与糖尿病大鼠心肌纤维化的关系研究 HE染色结果显示，ND组大鼠心肌纹理清晰，心肌细胞排列整齐，细胞核均匀分布，无变性、坏死，而各DM组大鼠心肌出现不同程度局灶性心肌细胞变性、坏死、纤维组织增生等。与ND组相比，4～16周时，DM组大鼠心肌组织中胶原沉积面积与胶原含量显著升高（P＜0.01，P＜0.05），呈持续递增趋势，均与时间的延长存在显著正相关关系（r=0.997，P＜0.01;r=0.997，P＜0.01）。Elisa实验结果显示，2～4周DM组大鼠血清中FBXW7含量显著增加（P＜0.01），第8周DM组开始降低，但仍显著高于正常对照组(P＜0.01);2～16周时，大鼠血清中TGF-β1和CTGF含量逐渐升高，8～16周显著升高(P＜0.01)，与时间的延长存在显著正相关关系（r=0.994，P＜0.01;r=0.990，P＜0.01）。与ND组相比，各周DM组SOD活力显著下降（P＜0.01），与时间为显著负相关关系(r=-0.965，P＜0.01);MDA水平显著升高(P＜0.01)，与时间为显著正相关关系(r=0.992，P＜0.01)。Western blotting和免疫组化结果均显示，各周DM组大鼠心肌中RhoA、ROCK1蛋白表达显著高于ND组（P＜0.01），且随着周期的延长，RhoA、ROCK1蛋白表达增加更加明显（P＜0.05），与时间的延长均有显著正相关性（r=0.967，P＜0.01;r=0.990，P＜0.01）;2～12周DM组大鼠心肌中的FBXW7表达相对于ND组显著增加（P＜0.01），但是相比于8周DM组，12周和16周DM组大鼠心肌中的FBXW7表达显著下降(P＜0.01)。 2.细胞实验 2.1细胞转染慢病毒 各组细胞生长状态良好且无明显死亡，荧光显微镜下观察到大量绿色荧光，慢病毒感染效率约80％以上，慢病毒转染成功。 2.2干预FBXW7表达对RhoA/Rho激酶信号通路及相关蛋白的影响 QRT-PCR检测结果表明，与低糖组相比，高糖组FBXW7表达量明显下降（P＜0.05），而RhoA、ROCK1的表达量显著升高（P＜0.01）;随着FBXW7的过表达，RhoA、ROCK1表达显著降低（P＜0.01）;而FBXW7的表达下调伴随着RhoA、ROCK1显著升高（P＜0.01）。Western blotting结果与qRT-PCR检测结果相一致，与低糖组相比，高糖组FBXW7表达量明显下降(P＜0.05)，而RhoA、ROCK1显著升高（P＜0.01，P＜0.05）;随着FBXW7过表达，RhoA、ROCK1表达明显降低（P＜0.05）;而FBXW7的表达下调伴随着RhoA、ROCK1明显升高（P＜0.05）。与低糖组相比，高糖组细胞内胶原含量显著升高（P＜0.01）。随着FBXW7过表达，细胞内胶原含量显著下降（P＜0.01）。而FBXW7表达下调伴随着细胞内胶原含量显著升高(P＜0.01)。Elisa检测结果显示，与低糖组相比，高糖组细胞内TGF-β1、CTGF含量显著升高(P＜0.01);随着FBXW7过表达，细胞内TGF-β1、CTGF含量显著下降（P＜0.01）;而FBXW7表达下调伴随着细胞内TGF-β1、CTGF含量显著升高(P＜0.01)。与低糖组相比，高糖组细胞内SOD活力显著下降（P＜0.01），而MDA含量明显升高(P＜0.05);随着FBXW7过表达，细胞内SOD活力明显升高（P＜0.05），而MDA含量显著降低(P＜0.01);而FBXW7表达下调伴随着SOD活力显著下降(P＜0.01)，MDA含量显著升高（P＜0.01）。 结论: 1.FBXW7与RhoA/Rho激酶信号通路参与了糖尿病大鼠心肌纤维化的发生发展。 2.FBXW7与RhoA、ROCK1的表达水平存在负性相关关系，FBXW7过表达可抑制RhoA/Rho激酶信号通路的激活。 3.FBXW7可通过抑制RhoA/Rho激酶信号通路的激活来减轻氧化应激从而改善糖尿病心肌纤维化。 4.促进FBXW7高表达有望成为治疗糖尿病心肌纤维化的新思路。
NETL