摘要
所有的好氧生物都需要面临“如何维持细胞内氧化还原稳态”这一问题。氧自由基(reactive oxygen species，ROS)包括过氧化氢、超氧阴离子自由基、羟基自由基和单线态氧，是造成细胞内氧化压力过大的重要原因之一，会导致生物大分子（蛋白质、DNA和脂类）受损，进而影响细胞生长。细胞内的ROS水平既受细胞内的新陈代谢影响，又受细胞生长微环境的影响。目前已知的能够清除ROS的蛋白酶包括过氧化氢酶、过氧化物还原酶(Peroxiredoxins、Prxs)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase，Gpxs)和一些依赖金属离子进行氧化还原反应的酶，而Prxs因为其催化中心结构的特殊性，对过氧化物更敏感，反应更迅速，因此在维持细胞内的氧化还原稳态发挥着重要的作用。 相比于其他的能够清除ROS的蛋白酶，人们对于Prxs的研究起步较晚，并且研究对象主要集中在真核生物，尤其是哺乳动物领域，对于古菌中的Prxs研究较少。而冰岛硫化叶菌REY15A作为一种嗜热嗜酸的泉古菌，其细胞内的Prxs是否具有特殊的性质和功能尚未可知。因此本课题开展了冰岛硫化叶菌REY15A中的Prxs性质鉴定和功能分析。 首先，我们通过生物信息学分析，找到了冰岛硫化叶菌REY15A中7种被注释（预测）的Prxs，分别是SiRe_0067、SiRe_0346、SiRe_0725、SiRe_0977、SiRe_1643、SiRe_2162、SiRe_2592，其中SiRe_1643和SiRe_2162是类Prxs家族，本课题没有开展进一步研究。我们分析了其余5种Prxs在古菌中的保守性，预测它们的活性位点。通过序列比对，我们发现SiRe_0067、SiRe_0346、SiRe_0725和SiRe_2592在古菌中的保守性较强，并且它们的催化位点满足PXXXT/SXXCp（Cp是催化活性位点的半胱氨酸）的序列。 然后，构建了在大肠杆菌与硫化叶菌中蛋白表达的质粒，表达纯化了野生型和活性缺失突变Prxs。接下来，我们对这些Prxs的体外性质进行了鉴定，以过氧化氢和叔丁基过氧化氢为底物，鉴定了这5种Prxs蛋白是否具有过氧化物酶活性并比较还原能力强弱的差异，结果发现SiRe_0346、SiRe_0067与SiRe_2592能够与过氧化氢和叔丁基过氧化氢发生氧化还原反应，具有较强的反应活性，而且C42是SiRe_0067的催化活性位点，C45/50是SiRe_2592的催化活性位点。以单链DNA、双链环状DNA、双链线性DNA为底物，鉴定这些蛋白是否具有与DNA相结合的能力以及影响其与DNA结合的因素分析，我们发现SiRe_0067和SiRe_0067-C42S（活性缺失突变体）能与DNA结合，SiRe_0067的氧化还原状态能够影响其DNA结合能力，被过氧化氢氧化后的SiRe_0067不能与DNA结合。鉴定了这些Prxs是否能够保护DNA免受羟基自由基（ROS中毒性最强的活性氧自由基）的损伤，我们发现SiRe_0067、SiRe_0346、SiRe_0725和SiRe_2592能够在一定程度上保护DNA免受羟基自由基的攻击，其中SiRe0346的保护能力最强。 接着，我们通过体内过表达这5种Prxs，分析蛋白过表达是否会对细胞生长造成影响，我们发现只有SiRe_0067过表达会使细胞生长趋势变慢，其余Prxs过表达对细胞生长没有明显影响。鉴定当细胞遭受氧化压力时，Prxs蛋白的过表达能否保护细胞免受氧化损伤，我们发现SiRe_0346展现出了较强的保护细胞免于氧化压力的作用。最后，对基因组上编码的Prxs的C末端原位添加6×组氨酸标签，通过Western-Blot实验进一步分析Prxs在正常状态下的细胞内的含量差异以及当细胞遭受氧化压力时，Prxs的表达水平的变化。 在体外性质鉴定的实验中，SiRe_0346展现出了能够高效地还原过氧化氧、叔丁基过氧化氢和羟基自由基的反应活性;在体内实验中，SiRe_0346能够在一定程度上提高细胞抵抗氧化压力的能力，由此，我们认为SiRe_0346在冰岛硫化叶菌REY15A中是维持细胞内氧化还原稳态的主要Prxs，而这一结果也与Sulfolobus solfataricus P2被UV处理后，SSO2121（SiRe_0346的同源蛋白）的转录水平翻倍相符合。在体外实验中，SiRe_0067与SiRe_2592也展现出了一定的清除过氧化物和自由基的能力，因此它们很可能在冰岛硫化叶菌REY15A中作为备份蛋白存在，当SiRe_0346不能发挥作用时能够保持细胞免受氧化压力的损伤。考虑到SiRe_0067的独特性质，作为Prxs中唯一一个具有DNA结合能力，并且唯一一个过表达后能够影响细胞生长的蛋白，我们推测SiRe_0067可能参与到细胞内的氧化信号传导途径，而SiRe_0067的氧化还原状态能够参与调节其功能。
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