摘要
蕨类植物是最原始的维管束植物，可分为5个门，现存最多的一类是真蕨门，真蕨门可以分为厚囊蕨、原始薄囊蕨和薄囊蕨三个纲。为了适应陆生环境以及抵御环境中的生物和非生物胁迫，蕨类植物体内产生了丰富多样的次生代谢产物，主要包括黄酮类、萜类和生物碱类等。黄酮类化合物在植物的生长发育过程中发挥着多种功能，同时黄酮类化合物可以作为膳食补充剂而且具有广泛的药理学活性。 黄酮类化合物的生物合成起始于苯丙氨酸，苯丙氨酸依次经过苯丙氨酸裂解酶(Phenylalanine ammonia-lyase，PAL)、肉桂酸-4-羟化酶(Cinnamic acid4-hydroxylase，C4H)、4-香豆酸-辅酶A连接酶(4-coumarate:coenzyme A ligase，4CL)的催化最终形成对香豆酰辅酶A(p-coumaryol-CoA)。然后，1分子的p-coumaryol-CoA与3分子的malonyl-CoA在查尔酮合酶(Chalcone synthase，CHS)的催化下形成柚皮素查尔酮。随后，查尔酮异构酶(Chalcone isomerase，CHI)将柚皮素查尔酮分子内立体特异性环化形成（2S）-柚皮素。CHI超家族包括四种类型。只有Ⅰ型和Ⅱ型CHI具有异构酶的活性。其中，Ⅰ型CHI可催化柚皮素查尔酮形成(2S)-柚皮素。而Ⅱ型CHI具有更广泛的底物选择性，它们不仅对柚皮素查尔酮具有催化活性，还能将异甘草素催化生成（2S）-甘草素。之前的研究认为Ⅱ型CHI只特异性的存在于豆科植物中。除了Ⅰ型和Ⅱ型CHI外，在拟南芥中还发现了另外的2种CHI蛋白，称为Ⅲ型和Ⅳ型CHI。Ⅲ型CHI不具有异构酶的活性，但具有脂肪酸结合活性。Ⅳ型CHI同样缺乏CHI的酶促活性，但它们可促进黄酮类化合物的生成和花色素的积累。 本实验室前期研究中发现，最早的陆生植物苔类植物和江南卷柏中已经具备了完整的CHI家族基因，而且它们产生的有催化功能的是Ⅱ型CHI而不是Ⅰ型CHI。这一发现，更新了对CHI进化的认识，表明早在苔类植物中已出现了真正的Ⅱ型CHIs。并且经对比发现，江南卷柏中Ⅱ型CHI的催化效率已经弱于几种苔类植物，更趋向于具有Ⅰ型CHI的特征。为了研究蕨类植物中CHI家族的种类和功能，本文筛选了52种蕨类植物的转录组数据库，根据基因功能注释，从中筛选出56个注释为CHI的基因，并分别命名。将其与苔类植物和江南卷柏中鉴定得到的Ⅱ型CHI进行进化树分析，并结合最近的一项蕨类系统发育研究，发现除了5个来自薄囊蕨中的CHI位于江南卷柏和原始薄囊蕨之间，其他51个CHI的进化与蕨类植物的整体进化大致相同。对它们预测的多肽序列分析发现，在蕨类植物CHIs中，用来确定Ⅱ型CHIs底物偏好的氨基酸残基（即Thr190和Met191:氨基酸编号依据苜蓿Medicago sativa CHI序列）分别被Thr或Ser和Ile所取代，与Ⅰ型CHIs相同。选取21种具有代表性的蕨类，从中克隆得到24个CHI基因，在大肠杆菌中进行异源表达，利用纯化后的蛋白进行体外酶活分析，结果发现有19个具有Ⅰ型CHI的功能，其他5个表现出弱的Ⅱ型CHI活性。蛋白同源模拟结合定点突变分析发现，Phe而不是Thr和Met决定了这些蕨类CHIs的Ⅱ型CHI活性。体内分析表明，从团叶陵齿蕨(Lindsaea orbiculata)和铁线蕨(Adiantum capillus-veneris L.)中克隆得到的2个CHI基因(即LoCHI1和AcCHIl)能互补tt5突变体种皮浅黄色的表型，提高黄酮醇和总花青素的含量，在生物体内具有完整的生物学功能。 同时，也研究了蕨类植物中Ⅳ型CHI的功能，通过检索铁线蕨和团叶陵齿蕨的转录组数据库，发现并克隆2个可能的CHIL基因和2个CHS基因，并将其分别命名为AcCHIL，LoCHIL，LoCHS1和LoCHS2。将其分别构建到原核表达载体pET32a中，最后得到重组蛋白。然后将这两个具有不同催化效率的CHSs分别联合LoCHIL进行体外酶活，实验结果表明CHIL抑制了CHSs催化反应过程中副产物4-香豆酰三乙酸内酯(4-Coumaroyltriacetic acid lactone，CTAL)的生成，从而促进柚皮素查尔酮的生成。同时酵母双杂交试验表明，LoCHIL可以与LoCHSs以及LoCHI1相互作用从而促进黄酮类化合物的积累。将AcCHIL和LoCHIL分别转入拟南芥chil突变体，与突变株相比，转基因植株内原花色素和黄酮醇含量有所增高，AcCHIL和LoCHIL弥补了突变体中缺失基因的功能。 综合以上实验结果，表明随着蕨类植物的出现，Ⅱ型CHIs进化为Ⅰ型CHIs。Ⅳ型CHI可以与CHS和CHI相互作用，促进CHS催化反应过程中形成的聚酮中间体的正确折叠和环化，从而避免副产物的形成;因此，Ⅳ型CHI能够促进黄酮类化合物的积累。
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