摘要
随着耐药菌的不断出现，新结构和新作用机制抗生素的发掘变得尤为迫切。微生物天然产物是新型抗生素的重要来源。基因组数据显示微生物基因组中含有大量隐性的次级代谢生物合成基因簇，基因组挖掘是发现这些隐性次级代谢产物的有力工具。多环特特拉姆酸大环内酰胺(polycyclic tetramate maerolactam，PoTeM)是一类具特特拉姆酸(tetramic acid)结构单元及多环体系的大环内酰胺类化合物，具有良好的生物学活性。根据多环体系的不同，PoTeMs可以分为5/5/6三环，5/6/5三环和5/5双环3个亚类，以HSAF(5/5/6)、ikarugamycin(5/6/5)和alteramide A(5/5)为主要代表。值得注意的是三环体系中第一个环有2种成环方式，如HSAF中为C14/C18成环，ikarugamycin中则为C15/C19成环。PoTeMs以其新颖的化学结构和独特的作用方式，正逐渐形成一个新的抗生素家族。 本研究基于PoTeMs类化合物核心基因的保守性和简洁性，以基因序列为指导定向寻找新PoTeMs类化合物。对课题组已有菌株的基因组分析，发现Streptomyces sp.S10和Streptomyces sp.S23中含有新PoTeM合成基因簇。通过对野生型S10和S23菌株进行培养条件的优化，未能从其发酵产物中分离得到PoTeMs类化合物，表明这两个基因簇可能处于沉默或低水平表达状态。因此，本论文开展了以下两个方面研究:1）Streptomyces sp.S10中PoTeM生物合成基因簇(cbm)的异源表达及组合生物合成研究;2）Streptomyces sp.S23中PoTeM生物合成基因簇（cft S23）的异源表达及组合生物合成研究。 生物信息分析表明Streptomyces sp.S10中含有可能编码5/5双环PoTeMs类化合物的基因簇。前期研究表明，编码PoTeM骨架合成的“核心基因”均处于同一个操纵子，这为进行新PoTeM途径的组装奠定了基础。本论文对cbm基因簇开展了以下研究:1）在核心基因cbmA-D操纵子上游引入强启动子kasOp*激活cbm基因簇并丛其异源表达突变株中分离得到3个新PoTeMs类化合物combamides A-C。2）通过基因敲除和代谢谱比较确证了cbm D基因负责combamides中C16，C30的氧化反应，并且从cbm A-C异源表达突变株中分离得到1个新PoTeMs类化合物combamide D。3）HSAF基因簇中的OX4基因已经被证实可以催化HSAFs中5/5/6三环系统的六元环的形成。通过组合生物学将OX4基因与cbm基因簇组合并从其异源表达突变株中分离得到2个新的5/5/6三环PoTeMs类化合物combamides E-F。 生物信息学分析表明Streptomyces sp.S23中含有可能编码5/6/5三环PoTeMs类化合物的生物合成基因簇。对cft S23基因簇开展了以下研究:1）在核心基因cftS23A-D操纵子上游及cftS23E基因上游分别引入强启动子kasOp*和ermEp*获得2个异源表达重组质粒，并将其导入Streptomyces sp.S001中进行异源表达。2)通过敲除cftS23D基因以期获得5/5双环含氧化修饰的PoTeMs类化合物。3）通过将cbm基因簇中cbmC基因原位替换成cftS23C基因，以期获得和ikarugamycins三环系统中第一个五元环成环方式相同的新颖的5/5双环PoTeMs类化合物。 综上所述，通过对Streptomyces sp.S10中PoTeM类化合物基因簇的激活及组合生物学的研究，共分离得到6个PoTeMs类化合物combamides A-F。在Streptomyces sp.S23中通过对cftS23基因簇的激活及组合生物合成研究，目前已经得到6个异源表达突变株，目标化合物的分离仍在进行中。
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