摘要
目的： 肥胖是一种代谢异常导致的脂肪过度积累，表现为脂肪细胞数量和大小的异常增加和变大。近年来研究显示，世界范围内的肥胖发病率逐年上升，在儿童和青少年人群中尤为明显。肥胖的主要原因是能量的摄入和消耗失衡，多余的热量以脂肪的形式储存。长期以来遗传因素、不健康饮食和生活方式通常被认为与肥胖发生有关。但随着现代化学工业的迅速发展，一些环境内分泌干扰物(endocrine disrupting chemicals，EDCs)越来越多的出现在我们的生活环境中，EDCs与肥胖的相关性也逐渐起了广泛关注。国内外大量研究证实，EDCs暴露与肥胖发生呈明显的正相关。这些物质作为增塑剂、除锈剂、阻燃剂等广泛用于工业、农业生产以及日化、食品包装、药品和化妆品生产中。目前已知这些物质可通过空气、食物、水等多种暴露途径进入人体。由于这些物质具有亲脂性、不可降解性，能在环境和机体内长期残留，因此可造成环境的污染，并影响机体健康，目前已成为重要的公共卫生问题。 作为EDCs之一的邻苯二甲酸二乙基已酯(2-ethylhexyl phthalate，DEHP)是一种被广泛添加在家居用品、食品包装、化妆品和医疗器械生产中的增塑剂，能够增强塑料的延展性。DEHP极易从塑料材料中逸出并污染环境，其中经口途径是人体最主要的暴露方式。流行病学研究资料提示DEHP暴露与肥胖关系密切，有研究证实DEHP能够促进脂肪的发生，DEHP是否参与了脂肪的分解机制尚未见报道。在本研究中，分别给予雄性C57小鼠喂饲常规饲料和高脂饲料(high fat diet，HFD)模拟人类的正常饮食和高脂饮食模式，同时经口给予人体日常接触剂量和能够引起肝脏和肾脏明显毒性的DEHP，观察了DEHP对实验动物体重、体内脂肪含量、脂肪代谢和糖代谢、血脂的影响，进一步观察了实验动物体内脂肪分解途径的改变，分析了DEHP与高脂膳食的交互作用。同时，采用体外观察了DEHP对3T3-L1细胞成脂分化的促进作用和脂肪分解的影响，初步探索了DEHP导致脂肪蓄积的机制，以期为肥胖的有效干预提供基本数据。 方法： 1.动物的饲养及处理 SPF级C57雄性小鼠72只饲养于屏系统。适应性喂养1周后，将小鼠随机分为6组，每组12只。分别为对照组、0.05mg/kg.bw DEHP组、500mg/kg.bw DEHP组、高脂饲料(high fat diet，HFD)组、0.05mg/kg.bw DEHP+HFD组、以及500mg/kg.bw DEHP+HFD组。高脂饲料组喂饲高脂饲料，其余动物喂饲常规颗粒饲料。玉米油稀释DEHP，按设置剂量经灌胃给予动物，染毒期间定期记录体重和饲料消耗情况，13周处死动物，留取组织样品进行指标测定。 2.葡萄糖耐量试验和胰岛素耐受试验 分别于实验第11周末和12周末进行葡萄糖耐量试验(glucose tolerance test，GTT)和和胰岛素耐受试验(insulin tolerance test，ITT)，动物禁食6h后，尾静脉取血测定血糖，记为0min血糖。然后动物经腹腔分别给予1.5g/kg.bw葡萄糖或0.4u胰岛素/kg.bw，检测15min、30min、45min、60min、90min、120min时测定血糖，分别绘制血糖变化曲线，并计算曲线下面积(area under the cure，AUC)。 3.体外细胞培养及处理 3T3-L1小鼠胚胎成纤维细胞培养于含有10％胎牛血清的高糖DMEM培养液中，同时添加1％的青霉素-链霉素，在37℃、5％CO2、饱和湿度下培养。将对数生长期细胞接种于6孔板，分别于37℃恒温细胞培养箱中培养2～3天，待细胞融合度达到90％以上后加入终浓度分别为3.125μM/L、6.25μM/L、12.5μM/L、25μM/L以及50μM/L的DEHP。采用含有4，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤溶液(IBMX)、胰岛素和地塞米松的诱导分化液1和只含有胰岛素的诱导分化液2进行诱导。诱导过程为诱导液1培养两天，换诱导液2培养两天，之后更换正常培养液。诱导完成后，采用油红O染色检测脂肪分化情况，并检测了细胞培养液中甘油三酯水平。收集细胞蛋白进行后续指标测定。 4.Western Blot 采用Western Blot分别检测脂肪组织以及3T3-L1细胞中脂肪分解途径相关蛋白水平的变化。具体包括蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、激素依赖的脂肪分解酶(hormone sensitive lipase，HSL)、磷酸化HSL（Ser563和Ser660）和解偶联蛋白1(uncoupling protein1，UCP1)，以及其上游的脂肪甘油三酯脂肪酶(adipose triacylglyceride lipase,ATGL)。 5.生化检测 采用全自动生化分析仪检测小鼠血清生化指标，具体包括高密度脂蛋白（high densitylipoprotein，HDL-C）、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL-C)、总胆固醇(total cholesterol，CHOL)、甘油三酯(triglyceride，TG)、总胆红素（total bilirubin，TBIL）、尿素氮(urea nitrogen，BUN)、白蛋白(albumin，ALB)、总蛋白(total protein，TP)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)以及谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)。 6.形态学检测 小鼠肝脏组织冷冻切片及诱导脂肪分化的3T3-L1细胞进行油红O染色，小鼠脂肪组织石蜡切片并进行HE染色;脂肪分化的3T3-L1细胞进行免疫荧光染色。 结果： 1.DEHP对小鼠体重、脂肪含量、器官及脏/体系数的影响 正常饲料和高脂饲料喂饲情况下，经口给予小鼠不同浓度的DEHP喂养12周。与对照组相比，0.05mg/kg.bw DEHP组体重增重明显升高（P＜0.01）;HFD组和0.05mg/kg.bw DEHP+HFD组体重增重也明显大于对照组(P＜0.01)，但两组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。与对照组相比，0.05mg/kg.bw DEHP组小鼠附睾脂肪和腹壁脂肪重量明显升高(P＜0.01)，棕色脂肪/体重系数降低(P＜0.05);HFD组、0.05mg/kg.bw DEHP+HFD、500mg/kg.bw DEHP+HFD组动物体内附睾脂肪和腹壁脂肪明显增加（P＞0.01），但各组间差异无统计学意义(P＞0.05);单纯高脂也明显升高了实验动物的棕色脂肪（P＜0.01）。与对照组相比，0.05mg/kg.bw DEHP肝脏和脾脏重量增加（P＜0.05，P＜0.01）;500mg/kg.bw DEHP组500mg/kg.bw DEHP组肝脏及肾脏重量增加(P＜0.05，P＜0.01)，睾丸明显减轻(P＜0.05，P＜0.01)。 脂肪组织石蜡切片HE染色发现，DEHP能够增加白色脂肪细胞体积。肝脏油红O染色显示，0.05mg/kg.bw DEHP能够明显增加肝脏中脂肪沉积。 生化检测发现，HFD组、0.05mg/kg.bw DEHP+HFD组和500mg/kg.bw DEHP+HFD组血清CHOL水平均远高于对照（P＜0.01）。与对照组相比，0.05mg/kg.bw DEHP组和500mg/kg.bw DEHP组以及所有喂饲高脂饲料组动物HDL-C均降低（P＜0.01），且DEHP剂量越高，HDL-C的水平就越低;动物血清LDL-C变化正好与之相反，0.05mg/kg.bw DEHP组和500mg/kg.bw DEHP组相比于对照，随着DEHP剂量的增高，LDL-C水平均逐渐升高（P＜0.05，P＜0.01），喂饲高脂饲料动物，LDL-C水平也远高于对照组（P＜0.01）。 2.DEHP对小鼠糖耐量和胰岛素敏感性的影响 GTT显示，HFD组、0.05mg/kg.bw DEHP+HFD组和500mg/kg.bw DEHP+HFD组实验动物AUC明显高于对照组（P＜0.05，P＜0.01），0.05mg/kg.bw和500mg/kg.bw DEHP暴露均能明显升高高脂饲料喂养条件下15min、30min和60min时实验动物血糖水平（P＜0.05，P＜0.01）。正常饲料喂养情况下，0.05mg/kg.bw和500mg/kg.bw DEHP对葡萄糖耐量影响不明显。统计学分析表明，0.05mg/kg.bw和500mg/kg.bw的DEHP与高脂饮食之间对于血液中葡萄糖水平的影响在30min和60min时存在协同作用(P＜0.05)。 ITT结果显示，高脂饮食能够导致实验动物胰岛素抵抗，其中同时给予0.05mg/kg.bw和500mg/kg.bw DEHP暴露，实验动物胰岛素抵抗更加明显。正常饲料喂养情况下，0.05mg/kg.bw和500mg/kg.bw DEHP对胰岛素敏感性影响不明显。统计学分析表明，0.05mg/kg.bw和500mg/kg.bw的DEHP与高脂饮食之间在30min时对于血液中葡萄糖水平的影响存在协同作用（P＜0.05）。 3.DEHP对3T3-L1细胞成脂分化影响 给予DEHP的3T3-L1细胞分化率均高于对照，其中12.5μM/L DEHP组升高最明显，升高水平接近38％(P＜0.01)。通过对细胞成脂分化的时间序列观察发现，12.5μM/L DEHP组脂肪滴出现的最早，约为更换诱导液1的第五天，其他组基本则在第六天时观察到较多的脂肪滴。采用异丙醇溶解油红O染色后的3T3-L1分化细胞，对溶出成分进行甘油三酯、游离脂肪酸以及甘油测定，结果显示，DEHP暴露细胞的三个指标均比对照有所升高;其中12.5μM/L DEHP组升高最为明显，其差异与对照组相比有统计学意义(P＜0.01)。 4.DEHP对实验动物及体外培养细胞脂肪分解通路相关蛋白的影响 小鼠腹壁脂肪组织的Western Blot结果显示，DEHP使PKA表达水平下调，其中500mg/kg.bw DEHP组下调了35.7％，与对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.01)。HSL的磷酸化水平降低，p-HSL(ser660)和p-HSL ser563比于对照明显下调，其中0.05mg/kg.bw DEHP组的p-HSL(ser563)下调了近100％(P＜0.01)，500mg/kg.bw DEHP组的p-HSL(ser660)下调了27.2％(P＜0.05)。与对照组相比，DEHP处理动物白色脂肪中UCP1的水平明显下调，0.05mg/kg.bw DEHP组和500mg/kg.bw DEHP组分别下调了46.1％(P＜0.01)和62.8％(P＜0.01)。小鼠棕色脂肪以及附睾脂肪中各种蛋白表达情况变化不明显。3T3-L1细胞免疫荧光染色发现，25μM/L、50μM/LDEHP处理的细胞内UCP1水平相比与对照有所降低。 结论： 1.DEHP长期暴露导致小鼠体重及体内白色脂肪增加，并导致胰岛素抵抗，升高血脂。 2.DEHP能够促进前脂肪细胞向脂肪细胞分化，增加体内脂肪细胞。 3.DEHP抑制脂肪分解过程，导致脂肪分解障碍，造成体内脂肪沉积。
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