摘要
机体被病原微生物入侵时，首先启动固有免疫应答，快速清除一部分入侵的病原体并激活适应性免疫，共同完成清除病原微生物的任务。免疫细胞的模式识别受体识别入侵病原微生物保守的病原体相关分子模式，引起一系列信号通路的活化，诱导细胞因子的表达，从而起到抑制或清除病原微生物的功能。细胞内存在多种模式识别受体，主要包括TLR、RLR、NLR、CLR以及一些DNA受体。病毒入侵机体后，其中的核酸成分作为主要的PAMP被识别，通过活化一系列接头分子，激活下游信号通路，最终诱导Ⅰ型干扰素的产生。胞内体中的DNA和RNA配体可以被膜受体TLR3、TLR7、TLR8和TLR9识别，通过MyD88(myeloid differentiation primary response protein88)或TRIF(Toll-interleukin-1domain containing adaptor protein inducing interferon)激活下游信号通路;而细胞质中的RIG-Ⅰ和MDA5作为主要的RNA受体，可活化下游定位在线粒体上的接头分子MAVS，MAVS可与TBK1(TANK-binding kinase1)结合，诱导Ⅰ型干扰素的产生;cGAS(cyclic GMP-AMP(cGAMP)synthase)作为细胞质中DNA受体，可以识别游离DNA，激活接头分子STING(stimulator of interferon genes)，诱导IRF3发生二聚化并进入细胞核，介导Ⅰ型干扰素的表达。在机体免疫应答中，Ⅰ型干扰素主要起抵抗病毒感染的作用，通过凋亡途径或抑制病毒的复制引起被感染细胞的凋亡，共同发挥抗病毒作用，而干扰素的异常表达可能导致自身免疫疾病的发生。因此，干扰素信号通路的活化需要受到严格的调控。 E3泛素连接酶TRIM家族在人类中有70多个成员。TRIM家族成员具有相似的结构特征，主要包括N端的一个RING结构域，一个或者两个B-boxes结构域，一个coiled coil结构域以及C端的可变结构域。TRIM10(Tripartite motif-containing protein10)定位于人的6号染色体短臂上，同时人的主要组织相容性复合体MHC(major histocompatibility complex)Ⅰ类分子也位于此区域，这提示TRIM10可能具有免疫调节功能。另外根据文献报导得知，同样位于6号染色体短臂上的其他几个TRIM分子，大多在抗病毒天然免疫信号通路中发挥着重要的调节作用，这也提示TRIM10可能在抗病毒免疫有某种调节功能。因此本论文探讨了TRIM10是否在抗病毒天然免疫中起到调节作用及其调控机制。根据研究结果得知TRIM10可以正向调控Ⅰ型干扰素的表达，且与TBK1有结合作用。 研究目的： 探讨TRIM10在抗病毒天然免疫中的作用，研究其具体的分子机制。 研究方法： 1)过表达TRIM10是否影响不同天然免疫信号通路所介导的干扰素的表达 在HEK293T细胞中，将TRIM10过表达质粒与DNA信号通路接头分子cGAS+STING过表达载体、RLR信号通路接头分子MAVS过表达载体以及Toll信号通路接头分子TRIF过表达载体分别进行共转染，培养24h后，利用qRT-RCR(quantitative real-time PCR)和荧光素酶报告基因的方法，检测TRIM10对不同信号通路接头蛋白所介导的IFN-βmRNA的表达以及IFN-β报告基因活性的影响。 2)敲低TRIM10的表达是否影响不同天然免疫信号通路中Ⅰ型干扰素的表达 使用8周龄的野生型小鼠，诱导出原代腹腔巨噬细胞，转染入对照小干扰RNA siCtrl和TRIM10siRNA，48h后，分别感染SeV0h、8h;感染VSV0h、4h、8h、12h;转染ISD、HSV-60或加入LPS进行时间点刺激，提取总RNA，反转录为cDNA，通过qRT-PCR检测不同信号通路所诱导的细胞因子表达变化。在人单核细胞THP-1中，转染入人TRIM10小干扰RNA，48h后，SeV感染8h，提取总RNA，反转录为cDNA，使用qRT-PCR检测不同信号通路所诱导的细胞因子IFN-βmRNA水平变化。 3)敲除TRIM10是否影响各个天然免疫信号通路介导的细胞因子的表达 取8周龄同窝生基因型为WT与TRIM10KO的小鼠原代腹腔巨噬细胞，分别感染VSV、SeV0h、4h、8h、12h;转染5'-pppRNA、ISD、HSV-60刺激0h、2h、4h、6h;LPS刺激0h、1h、3h、5h，通过qRT-PCR检测各个信号通路所诱导的多种细胞因子表达变化。 4)敲除TRIM10是否影响巨噬细胞抗病毒能力 取WT和TRIM10-/-小鼠腹腔巨噬细胞，VSV感染不同时间点，通过qRT-PCR检测RNA病毒VSV诱导IFN-β及其下游细胞因子的表达变化，通过ELISA检测上清中IFN-β蛋白分泌的变化。在WT和TRIM10-/-小鼠腹腔巨噬细胞中，VSV-GFP感染不同时间点，通过qRT-PCR检测细胞内VSV mRNA水平的变化，Western Blotting检测细胞内VSV-G蛋白水平的变化。 5)寻找TRIM10影响抗病毒天然免疫作用的靶分子 通过报告基因的方法初步检测TRIM10在抗病毒天然免疫信号通路可能作用的靶分子;免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)检测TRIM10与抗病毒天然免疫信号通路中各接头分子的相互作用。 研究结果： 1)过表达TRIM10上调天然免疫信号通路中IFN-β的表达 HEK293T中转染入TRIM10过表达载体和多条天然免疫信号通路接头分子，通过qRT-PCR检测Ⅰ型干扰素IFN-β在mRNA水平的变化，通过报告基因系统检测IFN-β启动子活性的变化，发现TRIM10过表达后各个抗病毒天然免疫信号通路所诱导的IFN-βmRNA水平和启动子活性较对照组表达均有升高。 2)敲低TRIM10的表达下调天然免疫信号通路中Ⅰ型干扰素的表达 取野生型小鼠的原代腹腔巨噬细胞，敲低TRIM10的表达，SeV，VSV激活RLR信号通路，ISD，HSV-60激活DNA信号通路，LPS激活TLR信号通路，使用qRT-PCR检测细胞因子在mRNA水平的变化，发现敲低TRIM10的表达后，细胞内Ⅰ型干扰素mRNA水平表达降低。 3)敲除TRIM10的表达下调天然免疫信号通路中多种细胞因子的表达 取同窝生基因型为WT与TRIM10KO的小鼠腹腔巨噬细胞，SeV，5'-pppRNA激活RLR信号通路，ISD，HSV-60激活DNA信号通路，LPS激活TLR信号通路，使用qRT-PCR检测下游细胞因子在mRNA水平的变化，发现Ⅰ型干扰素及其下游细胞因子表达降低。 4)敲除TRIM10降低巨噬细胞抗病毒的能力 取WT和TRIM10-/-小鼠腹腔巨噬细胞，VSV感染，qRT-PCR检测IFN-β及其下游细胞因子mRNA水平表达均有所降低，通过ELISA检测到上清中IFN-β蛋白分泌减少。在WT和TRIM10-/-小鼠腹腔巨噬细胞中感染VSV-GFP，检测到细胞内VSV在mRNA水平和蛋白表达均增强。 5)TRIM10靶向作用于TBK1 在HEK293T细胞中共转染TRIM10过表达质粒以及cGAS+STING、RIG-IN，MDA5，MAVS，TBK1，IRF3-5D过表达质粒。通过qRT-PCR和报告基因检测发现，在cGAS+STING、RIG-IN，MDA5，MAVS，TBK1激活信号通路后，TRIM10过表达可以增强IFN-βmRNA的表达，同时也增强了干扰素的启动子活性;而在IRF3-5D活化信号通路后，过表达TRIM10并不影响IFN-β的表达。免疫共沉淀结果显示，TRIM10与TBK1发生相互作用，而与cGAS、STING、RIG-Ⅰ，MDA5，MAVS，IRF3没有相互作用。 研究结论： 1)首次证明了TRIM10在抗病毒天然免疫中发挥正调作用，可以抑制病毒复制。 2)TRIM10靶向作用于TBK1，精确的调控机制还需要进一步研究。
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