摘要
卡拉胶酶广泛存在于自然界中，具有多种重要用途，能特异性的将卡拉胶水解成卡拉胶寡糖。为了提高酶的产量、简化酶的分离工艺及拓展卡拉胶酶的应用，可以对产卡拉胶酶菌株进行发酵、固定化卡拉胶酶和制备卡拉胶酶制剂。 本实验以实验室从红树林土壤腐叶中筛选得到的一株产卡拉胶酶的菌株ASY5为研究对象，对其发酵培养基及培养条件进行单因素优化，得到最佳的条件为:卡拉胶5g/L，胰蛋白胨5g/L,NaCl20g/L,CaCl20.2g/L,NaH2PO4·2H2O1.3g/L,Na2HPO4·12H2O3.82g/L,温度18℃，培养基初始pH为6.5，接种量2％，装液量70mL。优化后，生物量最大达到1.4，比初始条件下的生物量(0.776)提高80.4％;卡拉胶酶活力最大达到40.8U/mL，较优化前的酶活力26.8U/mL提高52.2％。然后对5L罐的发酵条件进行优化，结果表明，提高转速能促进产酶速率并缩短发酵时间，其中转速为280rpm时较佳，补料及控制pH对酶活力没有促进作用;最后在摇瓶及5L罐发酵基础上，进行20L、75L和200L的中试放大实验，结果表明，20L、75L和200L罐中的卡拉胶酶活力最大分别为33.9U/mL，34.7U/mL和36.1U/mL。其中200L罐中的最大酶活力为摇瓶中最大酶活力的88.5％，为5L罐中最大酶活力的85.7％。 柚皮是一种具有优良性能的新型载体，本实验采用柚皮-聚乙烯亚胺为载体对卡拉胶酶进行固定化，对固定化条件及固定化酶酶学性质进行考察，得到最佳的固定化条件:0.1mg/mL的聚乙烯亚胺溶液处理柚皮1h，pH缓冲液7.0，加酶量10U，固定化时间8h，固定化温度4℃。在最佳条件下酶活回收率达到50.0％，比初始条件的24.7％高1.0倍，比直接用柚皮固定化时的9.8％高4.1倍;卡拉胶酶经过柚皮固定化后，最适温度和pH分别为60℃和7.5，与游离酶相同，其温度稳定性较游离酶的变低，pH稳定性得到提高，在最适条件下重复使用3次后酶活力保留53.2％。固定化卡拉胶酶的Km小于游离酶的，与底物的亲和力变大。固定化酶和游离酶储藏14周后，固定化酶和游离酶的酶活力分别为初始酶活力的76.0％和82.5％;使用红外光谱对载体及酶进行表征，表明卡拉胶酶被成功的固定在柚皮载体上。 采用单因素与响应面结合的方法对喷雾干燥制备卡拉胶酶酶制剂的工艺参数进行考察，并得到最佳的工艺参数:麦芽糊精浓度27％，进风温度131℃，热风流量4.5m3/min，进料速度456mL/h，喷雾压力0.2MPa。在此条件下，酶活回收率为56.9％，比单因素结果提高12.7％;对卡拉胶酶酶制剂进行储藏稳定性研究，结果表明，在4℃和28℃保存13周后酶制剂活力均剩余93.0％以上;在干燥状态下保存13周后酶制剂活力仍剩余94.6％，在潮湿环境中不能敞口保存;紫外线照射120min后，卡拉胶酶酶制剂的活力仍保留55.4％。
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