摘要
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是老年期痴呆最常见的一种痴呆类型，以渐进性记忆障碍、认知功能障碍、语言障碍等为其主要临床表现。据统计，AD在中国65岁以上老年人中发病率在5.6％，而85岁以上老年人的发病率高达20％。目前，医学上有几种假说对AD的发病机制进行探讨，包括线粒体级联假说、Tau蛋白假说、Aβ毒性假说以及血管假说等。线粒体级联假说认为，细胞内产生的较多活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)，能够损伤线粒体，进而损伤神经元。Tau蛋白假说认为Tau蛋白过度磷酸化是AD发病机制之一。Aβ毒性假说认为Aβ具有神经毒性，在细胞中大量积累后形成Aβ老年斑，促使神经元细胞损伤或死亡。Aβ毒性假说和线粒体级联假说具有一定相关性。而血管假说则认为，由于年龄增大以及脑部多种血管疾病的原因，引起脑中供氧不足，易引发AD。这些假说虽然有一定的理论支持，但均不足以完整的阐释AD的发病机制。 近年来，长链非编码RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)的火热研究为AD发病机制的研究指明了另一个方向。已有的证据表明，BACE1-AS、51A和NDM29等lncRNA直接或间接增加了Aβ的形成并且影响Aβx-42与Aβx-40的比率，这些都可能与AD的发病机制相关。 我们的研究首先构建AD的细胞模型，由Aβ1-40诱导SH-SY5Y细胞，使细胞表现出较为明显的AD表型。基于此，本文旨在研究lncRNA17A在AD表型细胞中的作用及其潜在的调节机制。 第一章 目的：首先明确Aβ1-40对于SH-SY5Y细胞的活力是否有影响;其次检测Aβ1-40对SH-SY5Y细胞lncRNA17A的表达影响;最后检测过表达及敲低lncRNA17A之后，与Aβ1-40共同干预对于细胞的活力、凋亡、自噬、神经外胚层干细胞标记物Nestin表达以及细胞迁移和侵袭能力的影响。 方法：利用qRT-PCR方法检测Tau和p-Tau的mRNA表达来验证AD模型细胞的成功构建;通过MTT实验来检测Aβ1-40诱导后SH-SY5Y细胞活力以及lncRNA17A对Aβ1-40诱导损伤的SH-SY5Y细胞活力变化的影响;通过siRNA和pcDNA3.1(+)-lncRNA17A质粒转染来构建敲低及过表达lncRNA17A的细胞系;采用qRT-PCR检测Aβ1-40诱导后SH-SY5Y细胞中lncRNA17A的mRNA表达变化，敲低（沉默）和过表达lncRNA17A对Aβ1-40诱导损伤的SH-SY5Y细胞中lncRNA17A的mRNA表达变化;采用流式细胞仪检测不同组间细胞凋亡的变化;通过细胞的免疫荧光技术检测细胞自噬标记物LC3B(Light chain3B，LC3B)来检测细胞自噬的程度以及神经外胚层干细胞标记物Nestin的表达;最后用Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力的变化。 结果：1.与对照组相比，Aβ1-40处理的SH-SY5Y细胞总Tau和p-Tau的mRNA表达明显升高，表明AD模型细胞构建成功;Aβ1-40能够显著抑制细胞活性，并且具有浓度依赖性。 2.Aβ1-40能够诱导lncRNA17A在细胞中的表达量。 3.过表达lncRNA17A进一步抑制Aβ1-40诱导损伤的SH-SY5Y细胞活性，促进细胞凋亡，抑制细胞自噬，抑制细胞内神经外胚层干细胞标记物Nestin的表达，以及促进细胞的迁移和侵袭。 4.敲低lncRNA17A使Aβ1-40诱导损伤的SH-SY5Y细胞活性增加，抑制细胞凋亡，促进细胞自噬，促进细胞内神经外胚层干细胞标记物Nestin的表达，以及抑制细胞的迁移和侵袭。 结论：Aβ1-40能够显著抑制细胞的活性，促进细胞凋亡，抑制细胞自噬，抑制细胞内神经外胚层干细胞标记物Nestin的表达，以及促进细胞迁移和侵袭;敲低lncRNA17A使Aβ1-40诱导损伤的SH-SY5Y细胞活性增加，抑制细胞凋亡，促进细胞自噬，促进细胞内神经外胚层干细胞标记物Nestin的表达，以及抑制细胞的迁移和侵袭。 第二章 目的：本部分实验的目的在于探究Aβ1-40及lncRNA17A对于琥珀酸脱氢酶及Na+-K+-ATP酶活力的影响，因为两者是线粒体活性的重要标志，所以这两者变化能够反映Aβ1-40及lncRNA17A对线粒体活性的影响。 方法：按照说明书提取细胞中线粒体，并测定其琥珀酸脱氢酶及Na+-K+-ATP酶的活性。 结果：1.Aβ1-40组琥珀酸脱氢酶及Na+-K+-ATP酶活性明显受到抑制。 2过表达lncRNA17A后，与Aβ1-40组相比，Aβ1-40诱导损伤的SH-SY5Y细胞琥珀酸脱氢酶及Na+-K+-ATP酶进一步受到抑制。 3敲低（沉默）lncRNA17A后，与Aβ1-40组相比，Aβ1-40诱导损伤的SH-SY5Y细胞琥珀酸脱氢酶及Na+-K+-ATP酶活性增加。 结论：Aβ1-40能够抑制细胞线粒体的活性，但是敲低lncRNA17A后，Aβ1-40诱导损伤的SH-SY5Y细胞线粒体的酶活性有一定恢复。 第三章 目的：研究Aβ1-40及lncRNA17A对SH-SY5Y细胞中ROS、MMP、SOD和MDA的影响，这些物质间接表明线粒体的损伤程度，从而可以反映细胞对于Aβ1-40以及lncRNA17A的应答情况。 方法：本部分均采用试剂盒，按照试剂盒的要求检测各成分的变化情况。 结果：1.Aβ1-40能够诱导细胞内ROS、MMP、MDA的含量升高，而SOD的含量下降。 2过表达lncRNA17A后Aβ1-40诱导损伤的SH-SY5Y细胞中ROS、MMP、MDA的含量进一步增加，而SOD的含量进一步降低。 3敲低lncRNA17A后，Aβ1-40诱导损伤的SH-SY5Y细胞中ROS、MMP、MDA的含量减少，而SOD含量增加。 结论：Aβ1-40能够刺激细胞活性氧等物质的升高，激活氧化应激反应导致细胞损伤。敲低lncRNA17A后，各项指标均有所改善，说明lncRNA17A的表达下调能够改善Aβ1-40带来的部分影响。 第四章 目的：研究Aβ1-40对SH-SY5Y细胞中GABABR2表达的影响，并探讨干预lncRNA17A的表达是否能够对GABABR2的表达产生影响。 方法：采用qRT-PCR技术及western blotting技术分别检测不同处理情况下GABABR2mRNA和蛋白的表达情况。 结果：1.与空白对照组相比，A即-40处理后，细胞内GABABR2的蛋白和mRNA表达量均降低。 2与Aβ1-40组对比，过表达IncRNA17A后，Aβ1-40诱导损伤的SH-SY5Y细胞内GABABR2的蛋白和mRNA表达量进一步下降。 3与Aβ1-40组对比，敲低IncRNA后，Aβ1-40诱导损伤的SH-SY5Y细胞内的GABABR2的蛋白和mRNA表达量升高。 结论：Aβ1-40能够抑制细胞内GABABR2的表达。敲低lncRNA17A后，GAABABR2表达升高，说明lncRNA17A的表达下调能够改善Aβ1-40带来的部分影响。
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