摘要
目的: 本实验的研究目的是探讨HIPPO/TAZ信号通路在人类牙周膜干细胞的增殖，干性维持及成骨分化过程中的作用研究及机制探讨。 方法: 1、采用酶组织块消化法获取人牙周膜干细胞，流式细胞仪检测鉴定其干性标记物（CD90、CD44、CD105、CD73等），检测其是否具有成骨，成脂及成软骨分化能力。 2、采用带绿色荧光蛋白慢病毒感染系统对人牙周膜干细胞进行感染，分组为敲除对照(shNC)及敲除组(shTAZ)，过表达对照(Vector)及过表达TAZ组(TAZ+);分别用Western blot及RT-PCR检测我们对TAZ敲除和TAZ过表达的效率。 3、通过EdU染色检测各组间细胞增殖活性，CCK8法检测对照组及实验组细胞7天的增殖差异;并通过Western blot检测TAZ变化是否引起增殖相关信号通路（PI3K/AKT、ERK等）的变化。 4、流式细胞术分析过表达TAZ及敲除TAZ人类牙周膜干细胞凋亡差异;并通过Western blot检测凋亡相关蛋白(CASPASE3、BCL2、BAX)等的变化。 5、Western blot及RT-PCR检测各组细胞干性维持相关蛋白及基因(NANOG、SOX2、OCT4等)的表达水平差异。 6、对各组细胞同时进行成骨诱导，通过碱性磷酸酶染色及碱性磷酸酶活性定量检测TAZ敲除及过表达所导致的碱性磷酸酶活性差异;诱导21天，茜素红染色确定各组细胞间矿化结节生长量的差异;Western blot及RT-PCR检测诱导7天时各组细胞成骨相关基因及蛋白(COL1、ALP、RUNX2等)的表达差异。 7、SMAD3的化学抑制剂SIS3 HCL用于过表达TAZ组的h-PDLSCs中，与过表达TAZ组对照实验，茜素红染色检测其体外成骨分化和骨形成;Western-blot检测其成骨相关蛋白(ALP、RUNX2、COL1等)的表达。 结果: 1、成功分离并纯化人牙周膜干细胞，并成功的构建了过表达TAZ及敲除TAZ细胞模型。 2、过表达TAZ后，人牙周膜干细胞增殖能力增强，晚期凋亡减弱;并且过表达TAZ可引起p-AKT、p-ERK的表达水平上调。 3、敲低TAZ后，h-PDLSCs的增殖活性降低和细胞晚期凋亡比率增加;p-AKT、p-ERK的表达水平下调。 4、过表达TAZ组干性维持相关基因及蛋白表达水平上调，敲除TAZ组干性维持相关基因及蛋白表达水平下调。 5、成骨诱导7天后，过表达TAZ组的碱性磷酸酶活性显著增加，敲低TAZ组碱性磷酸酶活性显著降低;成骨诱导21天，过表达TAZ组矿化结节生成量显著增加。并且，成骨诱导7天后，过表达TAZ组的成骨相关蛋白及mRNA水平表达上调，敲低TAZ组的成骨相关蛋白及mRNA表达水平下调。 6、成骨诱导21天，相比过表达TAZ组，加SIS3 HCL(1uM)后茜素红染色，矿化结节生成量明显下调，并且成骨相关蛋白(ALP、RUNX2、COL1)等表达水平下调。 结论: HIPPO/TAZ在h-PDLSCs的增殖，干性维持和成骨分化中发挥正向调控作用，并且这种调控是通过TGFβ/SMAD3介导完成的。
NETL