摘要
作为重要的蛋白质翻译后修饰之一，糖基化在多种生命活动中起着关键作用。近年来，在诸多癌症中均能观察到血清N-聚糖的异常变化，表明血清N-聚糖能够作为癌症诊断的新型生物标志物。鉴于天然N-聚糖自身的性质，在特异性N-聚糖标志物研究中仍面临诸多挑战。首先，糖蛋白上的N-聚糖通常是痕量存在的，而天然N-聚糖低的质谱离子化效率也对高灵敏度衍生方法的开发提出了要求。此外，非模板驱动的合成方式增加了N-聚糖的微观不均一性和结构多样性，而异构体分析能够对N-聚糖的分支和连键信息进行更精细的解析，因此需开发新的方法以改善异构体的分离效果。另外，准确的N-聚糖定量分析有助于特异性癌症标志物的探究，但这类方法依然有限。针对以上问题，本文建立了多种衍生化策略以用于N-聚糖的定性定量分析，并对特异性癌症标志物进行了筛选。主要研究内容如下： na no LC-ESI-MS是N-聚糖异构体分析的重要工具。本文将甲胺化和还原化双衍生策略同na no LC-ESI-MS技术相结合并首次用于胰腺癌血清N-聚糖异构体的分离分析。甲胺化不仅可以使酸性N-聚糖得到中性化保护，还能有效改善检测灵敏度；而还原化可以使N-聚糖以糖醇形式存在，有效排除了α-和β-异头物的影响。通过对胰腺癌和健康样本血清中的N-聚糖异构体进行统计分析，筛选出25个具有显著性差异的异构体，其中有4个异构体的AUC值超过了0.90，表现出较高的诊断准确度。另外，这些特异性异构体还被用于胰腺癌早期诊断研究。 上述研究中，N-聚糖含量的变化是以相对含量的方式体现的，这种基于数据归一化的数据处理方式需要对每个 N-聚糖的含量进行统计。而本文则将 d0/d5-苯甲酰氯和甲胺化共衍生策略相结合以用于N-聚糖的定量分析，这种基于稳定同位素标记的定量方法可以更为直观地展现N-聚糖的变化。值得说明的是，本文利用微波辅助快速酶切实现糖胺的快速释放，较传统PNGase F过夜酶切，该方法仅需20 min的酶切反应时间，进而使整个N-聚糖分析流程缩短至4h。此外，未经任何修饰的酸性N-聚糖在 MALDI-MS 中会发生较为严重的源内或源后裂解，这种破坏是不可逆的，而采用甲胺化的衍生方式不仅能稳固唾液酸，还能提高N-聚糖的信号响应，进而实现中性糖和酸性糖的同时定量分析。另外，生物样本糖蛋白通常具有比较宽泛的动态范围，这就对衍生方法的定量能力提出了要求。以不同的摩尔比对核糖核酸酶 B （RNase B）中的高甘露糖型N-聚糖进行定量分析，其线性相关系数均超过了0.9992，展现了良好的线性定量能力。将该方法应用到骨髓瘤患者血清N-聚糖的分析，筛选出5个可用于早期诊断的特异性N-聚糖标志物。 在上一章研究的基础上，将na no LC-ESI-MS技术用于d0/d5-苯甲酰氯和甲胺化双衍生修饰的N-聚糖异构体的定量分析。由于同位素标记的N-聚糖的衍生和分析流程是同步进行的，能够有效消除离子化效率、电荷分布、离子抑制效应和质谱信号响应偏差给N-聚糖定量带来的干扰。通过对标准品N-聚糖进行分析，不仅验证了该方法的可行性，还实现中性糖和酸性糖异构体的有效分离。另外，对源自RNase B 的H5N2的异构体进行不同摩尔比的定量分析，其线性相关系数（R2）均超过了0.9988。同时，我们也对该方法的重现性以及准确性进行了评估，其平均C V值和RE值均未超过4.88%和3.02%，上述结果表明该方法在定量糖组学方面具备良好的稳定性和准确性。该方法还被首次用于同一骨髓瘤患者不同给药阶段血清N-聚糖异构体的分析，找到一些能够作为药效预判的特异性N-聚糖标志物。 在上述研究的基础上进一步建立了基于血清特异性糖蛋白——转铁蛋白（transferrin）的N-聚糖异构体定量方法。由于仅对专一性糖蛋白进行分析，能够排除其他糖蛋白对N-聚糖定量带来的干扰。此外，具有不同连键类型唾液酸的N-聚糖会参与不同的生理调控过程。因此，对N-聚糖唾液酸连接类型的解析十分重要。本文将PGC色谱分离技术用于稳定同位素标记的转铁蛋白N-聚糖异构体的分离分析，同时结合特异性α 2-3糖苷外切酶，在同一检测批次内实现N-聚糖异构体唾液酸连接类型的有效识别。另外，通过对标准转铁蛋白N-聚糖异构体进行分析，实现更宽泛的线性定量范围, 较第三章基于MALDI-MS的糖组成分析其在定量能力上得到有效改善。该方法还被用于特异性骨髓瘤标志物的筛选，为药效预判提供参考。 以上章节中用于 N-聚糖衍生的试剂是不具备荧光基团的，因而不能直接用于HPLC 荧光检测。本文建立了一种基于 9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯（ Fmoc N-hydroxysuccinimide ester，Fmoc-OSu）的N-聚糖分析方法，较为便捷地为N-聚糖提供了荧光标签。通过微波辅助快速酶切，极大缩短了酶切反应时间，有效防止了糖胺的水解。此外，Fmoc基团的引入也显著提高了N-聚糖的信号响应，有助于低丰度N-聚糖的检测。值得说明的是，如今可用于糖标准品制备的方法依然很少，而现有方式的制备流程又过于复杂，不利于高纯度糖标准品的制备。本文通过对 F moc基团进行有效释放，成功制备出较高纯度的N-聚糖标准品，为生物大分子互作性研究提供了可能。另外，该方法还被用于肺癌患者血清N-聚糖的分析，以筛选能进行早期诊断的特异性N-聚糖标志物。 综上，本文从糖组成和异构体分析角度对N-聚糖进行了定性定量研究。甲胺化的衍生方式有效稳固了唾液酸基团，进而使中性糖和酸性糖的同时定量分析成为可能。此外，不仅对酸性N-聚糖异构体上唾液酸的连接类型进行了有效解析，还成功制备出N-聚糖标准品。另外，对癌症血清样本的分析为特异性N-聚糖标志物的探寻提供了应用前景。
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