摘要
目的 观察腺病毒介导的人凝血因子 Ⅸ（hFⅨ）基因在小鼠脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）中的表达情况。 方法 1细胞分离培养及鉴定 准备4只3~4 周龄雄性 SPF 级C57BL/6J小鼠，采用颈椎脱臼法将小鼠处死，在超净台中操作，提取位于两侧腹股沟处的脂肪组织，用 1%胶原酶充分消化，获得单细胞悬液，接种在培养瓶，进行原代小鼠脂肪干细胞及传代培养。对细胞形态进行观察，用 CCK-8 试剂法测定细胞生长曲线，采用流式细胞术对细胞表型进行鉴定，成脂成骨诱导对细胞分化潜能进行鉴定。2 细胞分组及转染 选取生长旺盛的第 3 代 ADSCs，随机分成 3 组：空白组：将 DMEM作为对照加入 ADSCs 培养瓶，空载组：以空病毒 Ad-GFP 转染 ADSCs，实验组：以重组腺病毒 Ad-hFⅨ转染ADSCs。将携带hⅨ基因的腺病毒转染小鼠脂肪干细胞，将转染后的 ADSCs 与未转染时细胞形态及生长曲线进行对比，观察两组之间有无变化。3 转染后细胞检测 采用 RT-PCR 检测细胞中 hFⅨ 基因的表达情况，应用Western blot检测细胞内以及培养细胞上清液中hFⅨ蛋白的表达。采用ELISA 法测定细胞上清中的 hFⅨ 蛋白量(FⅨ∶Ag)，一期法检测培养细胞上清液中hFⅨ蛋白活性(FⅨ∶C)。 结果 1细胞形态及生长曲线 小鼠ADSCs离体培养最初几小时呈体积较小的圆球形，具有很强的折光性，贴壁生长时间为种瓶后 4~6 小时，细胞变为长梭形纤维状为种瓶后72 h，漩涡状排列；第3代ADSCs体外培养1~2天生长速度较缓慢， 3~5 天增殖速度增快，呈指数倍扩增，6~7 天生长速度逐渐缓慢，总体生长趋势呈S 型；2 成脂成骨诱导 油红 O 对诱导后细胞进行染色，用倒置显微镜观察，可见红色脂滴形成。茜素红对诱导后细胞进行染色，用倒置相差显微镜观察，可见橙红色钙化骨节。3 流式细胞表型鉴定 第 3 代 ADSCs 高表达 CD29（99.91%）， CD90(99.02%)，几乎不表达 CD45（0.94%）。4 病毒转染 取 MOI=300，病毒转染后24h、48h、72h后，观察细胞表达GFP强度，发现细胞表达GFP最强时间在转染后 72h，转染效率可达 80%以上。观察 ADSCs 与未转染时形态无明显改变。5细胞mRNA的表达 RT-PCR结果显示hFⅨ基因可以在小鼠脂肪干细胞内表达。6细胞内及上清中hFⅨ蛋白表达Western blot结果显示小鼠脂肪干细胞内及培养细胞上清液中均可表达 hFⅨ 蛋白。7 转染细胞 FⅨ∶Ag 检测 ELISA 测定转染ADSCs培养上清FⅨ∶Ag：第1d为21.33±3.93 g/(106cells·24h)，第3d为12.63±0.86ng/(106cells·24h)，第9d为12.63±2.36ng /106cells·24h)。8FⅨ∶C检测一期法检测培养细胞上清液中 FⅨ∶C 为 8.5%。说明腺病毒能够成功转染小鼠脂肪干细胞使其分泌hFⅨ蛋白，为后续细胞疗法治疗血友病B奠定了基础。 结论 1 携带 hFⅨ 基因的腺病毒能有效转染 ADSCs；2 hFⅨ 基因修饰的 ADSCs可以分泌具有凝血活性的hFⅨ蛋白。
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