摘要
糖尿病（diabetes meilitus，DM）是由胰岛素分泌障碍或生物作用受损引发的一组以慢性高血糖为特征的代谢性疾病。世界范围内成人糖尿病患者人数截止2010年为2.85亿，到2030年这一数字估计将增至4.39亿，对于人类健康产生了严重的威胁。持续的高糖刺激导致机体血管受损并累及心、脑、肾、眼睛等器官。糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy， DCM）是糖尿病常见的并发症之一，是独立于高血压、心肌缺血和心肌瓣膜病导致心脏结构和功能异常的心肌病，主要病理表现为心肌炎症、心肌纤维化、心肌凋亡及心功能障碍等。目前，针对DCM的治疗主要通过有效控制血糖，降低血压、血脂以缓解并抑制心力衰竭，然而西药治疗有不同程度的副作用且治疗效果缺乏针对性，中草药因其低毒、多靶点等特点在防治心血管疾病方面有着天然的优势。 牡丹皮在传统中医中常用来治疗心脑血管疾病。丹皮酚（paeonol， Pae）来源于牡丹的根皮，是牡丹皮最主要的有效成分之一，具有抗氧化、降血脂、降血糖、抗心律失常和抗炎等多方面的药理作用。本课题组前期研究证实丹皮酚对大鼠心肌梗死后的心室重构有改善作用。然而丹皮酚对大鼠DCM的保护作用相关研究尚未见报道。本研究通过构建DCM大鼠动物模型，观察大鼠心肌结构和功能改变，进一步探讨丹皮酚对DCM的保护作用及其氧化应激信号转导机制。 第一部分 丹皮酚对大鼠糖尿病心肌病的保护作用 目的： 观察丹皮酚对大鼠DCM心肌结构和功能改变的影响，进一步确证丹皮酚对DCM的保护作用。 方法： 1 DCM模型的制备：SPF级雄性SD大鼠体重（150±10）g，普通饲料适应喂养 1 周后，造模大鼠喂以高脂高糖饲料喂养 6 周，禁食不禁水18小时，连续2天腹腔注射小剂量链脲佐菌素（STZ）25 mg·kg-1，构建Ⅱ型糖尿病大鼠模型，在注射STZ后分别于第3、7天，取大鼠尾静脉血并测量血糖，空腹血糖值均≥16.7 mmol·L-1，则Ⅱ型糖尿病大鼠模型制备成功，12周后，每组分别取1只大鼠进行组织形态学检测，出现心肌病理改变，心肌细胞肥大，心肌胶原纤维排列紊乱，呈现不同程度的心肌纤维化，说明DCM模型制备成功。 2 实验分组：雄性SD大鼠，设正常组（NC组）、模型组（MC组）、丹皮酚低剂量组（Pae-L组，30 mg·kg-1）、丹皮酚中剂量组（Pae-M组， 60 mg·kg-1）、丹皮酚高剂量组（Pae-H组，120 mg·kg-1）、二甲双胍阳性药组（DMBG组，157 mg·kg-1）。第9周开始药物干预，丹皮酚以及二甲双胍分别溶于羧甲基纤维素钠（1%）灌胃，NC组和MC组分别灌以等体积羧甲基纤维素钠，1次/天，给药12周。 3 指标检测：测量各组大鼠空腹血糖（FBG）和体重(BW)后取材，并称取各组大鼠心脏重量（HW）测量其心脏重量指数（HWI，心脏重量/体重）；采用全自动生化仪测量总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）；采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ ELISA ）测量晚期糖基化终末产物（AGEs）、糖化血红蛋白(GHb)、乳酸脱氢酶(LDH)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)的含量；苏木素-伊红染色（HE染色）和Masson染色观察各组大鼠心肌病理改变以及心肌纤维化程度；Western blot法检测Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白蛋白表达。 结果： 1 Pae对各组大鼠BW、HWI的影响 与NC组相比，MC组大鼠BW明显下降（P＜0.05），HWI明显增加（P＜0.05）；与MC组相比，Pae-L组、Pae-M组、Pae-H组及DMBG组BW有不同程度增加（P＜0.05）， HWI有不同程度降低（P＜0.05），其中Pae-H组较之Pae-L组、Pae-M组对BW、HWI的影响更为显著。 2 Pae对各组大鼠血糖、血脂水平的影响 与NC组相比，MC组大鼠FBG、GHb、AGEs、TC、TG增加明显（P＜0.05）；与MC组相比， Pae-L组、Pae-M组、Pae-H组及DMBG组FBG、GHb、AGEs、TC、TG均有不同程度降低（P＜0.05），其中 Pae-H 组对各项指标的改善效果更显著。 3 Pae对各组大鼠血清中CK-MB、AST、LDH的影响 心肌组织标志物 CK-MB、AST、LDH 结果显示：与 NC 组相比，MC 组血清中的CK-MB、AST、LDH均有明显增高（P＜0.05）；与 MC组相比，Pae-L组、Pae-M组,Pae-H组、DMBG组中的CK-MB、AST、LDH则有不同程度的下降（P＜0.05），其中Pae-H组对各项指标的改善效果更显著。 4 HE 染色结果 HE 染色封片固定后用光学显微镜观察大鼠心肌组织，NC组心肌细胞和心肌纤维形态正常；与NC组比较，MC组心肌细胞肥大，心肌纤维排列紊乱，出现纤维断裂、溶解，心肌细胞间着色不均匀，胞核破碎甚至消失；与MC组相比，Pae-L组、Pae-M组、Pae-H组、DMBG组心肌的病理改变均有不同程度的改善，心肌纤维排列比较规律，着色比较均匀，其中Pae-H组较之Pae-M组、Pae-L组，改善更明显。 5 Masson染色结果 光学显微镜观察各组大鼠心肌纤维化程度，NC组以红色的心肌细胞为主，心肌间质中没有明显的心肌胶原纤维增多；与NC 组相比，MC 组心肌细胞、间质胶原纤维（蓝色）明显增多；与 MC组相比，Pae-H组、Pae-L组、Pae-M组、DMBG组的心肌胶原纤维增生均有不同程度的改善，其中Pae-H组的蓝色条带最少，胶原纤维改善最明显。 6 Western blot法检测Ⅰ型胶原蛋白（Col-Ⅰ）、Ⅲ型胶原蛋白（Col-Ⅲ）蛋白表达 NC 组心肌组织中 Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表达相对较低，与 NC组相比，MC组中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的沉积会增加，和其心肌纤维化的程度呈正相关（P＜0.05)；与 MC 组相比，Pae-H 组、Pae-M 组、Pae-L组、DMBG组的Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表达有不同程度的降低，其中Pae-H组对Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的改善更为明显。 结论： 1 Pae能够降低DCM大鼠FBG、GHb、AGEs、TC、TG含量，改善了血糖、血脂水平，对DCM大鼠心肌损伤起保护作用。 2 Pae能够降低DCM大鼠血清CK-MB、AST、LDH含量，使心肌酶释放量减少，降低了DCM大鼠心肌损伤程度。 3 Pae能够降低HWI的水平，改善心肌结构。 4 Pae抑制了DCM大鼠的心肌组织中col-Ⅰ、col-Ⅲ的表达，改善了心肌细胞中心肌纤维的紊乱排列，降低了心肌组织的纤维化程度，对DCM大鼠心肌起到了保护作用。 第二部分 丹皮酚对大鼠糖尿病心肌病发生发展的氧化应激信号通路的影响 目的： 观察丹皮酚是否可以通过激活 Nrf2/ARE 通路、抑制 AGEs/RAGE/NOX信号通路来缓解糖尿病心肌病的发生和发展。 方法： 模型的制备和实验分组与第一部分方法中1和2相同。用超氧化物歧化酶（SOD）测试盒（WST-1 法）和丙二醛（MDA）测试盒（TBA 法）分别测定心肌组织中的SOD活性和MDA含量变化，Real Time PCR 法（qRT-PCR）检测各组大鼠心肌组织中Nrf2、RAGE、NOX、NF-κB p65的mRNA表达水平；Western blot法检测Nrf2、RAGE、NOX、NF-κB p65蛋白表达水平。 结果： 1 对SOD活性和MDA含量的影响 与NC组相比，MC组心肌组织中的SOD活性明显降低（P＜0.05），MDA含量有明显升高（P＜0.05）；与MC组相比，Pae-L组、Pae-M组、Pae-H组中的SOD活性不同程度的升高（P＜0.05），MDA含量有不同程度的下降（P＜0.05）。其中Pae-H组对各项指标的改善效果更明显。 2 qRT-PCR结果 与NC组对比，MC组心肌组织中Nrf2的mRNA表达水平显著降低（P<0.05），RAGE、NOX、NF-κB p65 mRNA表达升高（P<0.05）；与MC组对比，Pae-L组、Pae-M组、Pae-H组心肌组织中Nrf2的mRNA表达有不同程度的升高（P<0.05），RAGE、NOX、NF-κB p65 mRNA的表达有不同程度的减低（P<0.05），其中Pae-H组较之 Pae-L 组、Pae-M 组，RAGE、NOX、NF-κB p65 降低明显，Nrf2升高明显。 3 Western blot检测结果 与NC组对比，MC组心肌组织中Nrf2的蛋白表达水平显著降低（P<0.05），RAGE、NOX、NF-κB p65 的蛋白表达水平显著升高（P<0.05）；与MC组对比，Pae-L组、Pae-M组、Pae-H组心肌组织中 Nrf2 的蛋白表达有不同程度的升高（P<0.05），RAGE、NOX、NF-κB p65蛋白的表达均有不同程度的减低（P<0.05），且Pae-H组较Pae-L组和Pae-M组Nrf2升高明显，RAGE、NOX、NF-κB p65减低明显。 结论： 1 Pae能够提高DCM大鼠心肌组织Nrf2的基因表达，上调SOD等抗氧化酶的表达，降低MDA的含量，提示丹皮酚对DCM大鼠心肌的保护作用可能是通过激活 Nrf2/ARE 信号通路，提高机体清除 ROS 的能力而实现的。 2 Pae能够减少DCM大鼠体内AGEs的产生，抑制RAGE、NF-κB p65基因的表达，降低了NADPH氧化酶的活性，减少ROS的生成，表明丹皮酚对 DCM大鼠心肌的保护作用可能与抑制 AGEs/RAGE/NOX 信号通路有关。
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