摘要
尿路感染(Urinary tract infections, UTIs)是泌尿系统常见的感染。流行病学数据显示，在感染性疾病中UTIs的发病率仅次于呼吸道感染，居第二位。女性由于解剖学特点，特别容易罹患 UTIs，大部分女性一生至少经历过一次 UTIs。并且部分患者的UTIs容易反复发作，因此经常反复就医并需长期交替服用各类抗菌药物，容易诱导临床耐药菌株的产生及传播。以往的研究认为引起UTIs的致病菌起源于肠道内，移行至尿道通过侵袭泌尿系统的上皮细胞后定植，然后上行至膀胱引起感染，因此90%UTIs的临床症状表现为急性膀胱炎。在引起UTIs的致病菌中以大肠杆菌最为常见，其中UTIs的复发约有86%由大肠杆菌引起，目前将引起此类引起UTIs的大肠杆菌称之为尿路致病性大肠杆菌（UropathogenicEscherichia coli， UPEC）。近年来的研究发现在UTIs复发中的UPEC中有50%-78%的菌株和初发感染属于同一种分子型别（molecular type），由此可以推测引起UTIs的病原菌可能不完全来自于肠道。此外，临床治疗中发现的问题在于UTIs的治疗中即使有些细菌在体外的抗生素药敏实验结果显示敏感，但是细菌仍然可以耐受体内的抗生素治疗浓度，从而产生“有药无效”的困惑。因此推测在体内，UPEC可能通过调节其自身代谢状态适应了抗生素环境，在抗生素选择性压力去除后继续导致感染的复发。 第一部分 尿路感染中致病性大肠杆菌（UPEC）的分子生物学特征 鉴于目前的临床现状，本次研究通过前期临床收集并筛选出引起尿路感染复发的UPEC菌株，通过对入选菌株的凝胶脉冲场电泳（PFGE）进行同源性分型，将感染复发分为新发感染组和复发感染组。检测UPEC的多序列位点分型（MLST）、种系发生分型、抗菌药物敏感性实验、毒力因子携带率等手段比较不同感染类型之间UPEC的生物特征性差异。并进一步筛选出一株引起尿路感染复发的ST131型大肠杆菌29-1用于下一步的发光菌株构建和基因功能性研究。 第二部分 UPEC在不同阿米卡星浓度下的耐受生长特性 通过对尿路感染复发中UPEC的抗菌药物敏感性实验的结果进行分析，发现不同感染类型的菌株对抗生素的耐药性没有明显差异。为了进一步探讨UPEC在体外抗菌药敏实验显示对药物敏感，却能够在体内抗生素治疗浓度下耐受，并且在抗生素压力消失后造成感染复发的特征。我们拟检测了在不同抗菌药物浓度下UPEC的生长曲线法，通过系列稀释涂板计数菌量，分析在不同阿米卡星浓度下UPEC菌株的耐受生长情况。研究结果显示引起UTIs复发的UPEC菌株中以ST131型的菌株在高浓度阿米卡星环境下的呈现低浓度生长的比例最高，因此我们推测ST131型大肠杆菌能够耐受体内的不同抗生素浓度环境，呈现一种低浓度生长的状态以适应宿主的泌尿道抗生素环境，在抗生素压力消失后ST131型大肠杆菌最易造成UTIs的复发。 第三部分 UPEC发光菌株的构建 通过重叠延伸聚合酶连反应技术（SOE-PCR）将增强启动子gapA序列插入携带e-GFP的pKOR1质粒中。应用电转将携带 gapA 和绿色荧光基因e-GFP的“pKOR1-gapA-e-GFP”质粒转入氨苄西林敏感的大肠杆菌临床株ST131中。将电转后的菌液涂布在含有100 ug/ml氨苄西林浓度的TSA培养基上，35℃培养过夜。挑取单个菌落经过临床连续传代7天，通过荧光显微镜下观察荧光强度验证菌株发光的遗传稳定性。构建出一株用于体内研究并且能稳定荧光发光的大肠杆菌菌株“29-1-gapA-eGPF”，将其进一步用于小鼠尿路感染模型，研究UPEC在体内的抗生素治疗浓度下如何在细胞内逃避宿主的免疫机制。采用能够稳定发光的临床菌株制作的小鼠感染模型可以更真实的反映病原菌在体内感染的实际情况。此外，通过体外实时定量监测细菌的发光强度可以反映出宿主体内的感染状态，同时减少实验动物消耗量。 本次研究以临床问题为背景，通过前期临床筛选、抗菌药物敏感性实验，同源性分析、分子流行分型、毒力因子携带，分析了UPEC的生物学特性与UTIs不同感染类型的相关性。通过检测前期菌株在不同阿米卡星浓度下的耐受生长情况，明确了引起UTIs复发最常见的ST分子型别，为进一步阐明UPEC的分子型别与尿路感染预后的相关性提供了理论基础。通过前期研究，筛选出用于进一步构建能够携带发光荧光质粒的临床菌株29-1，通过基因重组技术将带有增强启动子的荧光发光质粒插入该临床菌株，并体外传代验证其荧光的稳定性。由于临床感染株在生物学特征和遗传背景上更能真实的反应体内的感染状况，因此使用该菌株比使用工具菌更适合制作动物尿路感染的模型。
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