摘要
水葫芦(Eichhornia crassipes)是一种外来入侵植物，它能够高效吸收氮和磷，因此在富营养化水体中能够快速生长。它的疯长破坏了水体生态平衡，造成很大经济损失，但控制种养水葫芦，又可以利用它来净化水质，因此研究水葫芦磷转运蛋白基因（Eichhornia crassipesphosphate transporter,EcPHT），有利于揭示水葫芦对富营养化水体中磷吸收的分子机理，揭示水葫芦快速入侵的分子机理，为水葫芦合理开发和利用提供理论基础。磷(Phosphorus,P)是植物生长发育过程中不可缺少的营养元素，是核酸、ATP、磷脂的重要组成之一。研究水葫芦运蛋白基因能够为高效吸收磷的经济作物高效磷吸收提供借鉴，能够为优良农作物的遗传育种提供新的基因资源。 本文利用二十多种植物的高亲和力磷转运蛋白（Phosphate Transporter1,PHT1）基因保守序列设计出简并引物，克隆出水葫芦EcPHT中间片段710bp。利用RACE技术，获得EcPHT基因的5’端和3’端片段，EcPHT基因全长序列通过拼接获得。EcPHT基因完整的开放阅读框1572bp，编码523个氨基酸，该基因的分子量为57.009kD，等电点为8.95，含有信号肽和11个跨膜区，是一个稳定、疏水蛋白。EcPHT基因的结构与MFS转运子和糖转运子相似度很高，该基因的氨基酸序列与油棕、铁皮石斛、枳壳、柑橘植物PHT1基因相似度达到80%以上。 通过酵母功能互补试验，验证了175μMP时EcPHT基因能够互补磷缺陷型酵母菌PHO84的功能，揭示该基因能够转运磷。在不同pH值条件下生长，缺陷型酵母菌PHO84最适合生长的pH值为6，酸性条件有利于磷转运蛋白突变体酵母的生长。 用叶盘转化法将农杆菌EHA105介导的EcPHT基因转到烟草中，转基因烟草的根数比野生型多，苗的健壮程度也比野生型的好，其中转基因中烟100烟草结果比较显著。在0.1mMP低磷条件下，转基因烟草比野生型烟草生长得好。 利用荧光定量PCR方法检测不同培养条件下EcPHT基因在水葫芦和转基因烟草根部和叶子中的表达量，以及烟草自身磷转运蛋白(Nicotiana tabacumphosphate transporter,NtPHT)和烟草低磷胁迫相关转录因子(Nicotiana tabacumphosphate starvation response,NtPHR)在转基因烟草中的表达情况。实验结果显示缺磷胁迫下能够提高水葫芦根部EcPHT基因的表达能力，在0mMP条件下，72h时EcPHT基因在水葫芦根部表达量明显增加。水葫芦在缺磷下培养后转到1mMP下培养，EcPHT基因在水葫芦叶子中表达受抑制。在MS培养40天后，相对野生型烟草EcPHT基因在转基因中烟100烟草根部和叶子中明显表达，根中NtPHT基因表达量在转基因中烟100烟草中显著升高而在转基因YK180烟草中略下降，NtPHR基因表达量在转基因中烟100烟草根部和叶子中都略升高。磷浓度为0.1mM时，可促进NtPHT基因在中烟100烟草根中表达，是NtPHT基因在转基因YK180烟草根中表达量最高的磷浓度，而野生型Y K180根中表达量最高的磷浓度为MS培养液。在2mMP条件下，抑制了EcPHT基因在转基因中烟100烟草根部和叶子中表达，而提高NtPHR基因在转基因中烟100烟草根和叶中的表达能力。 运用钼蓝比色法检测水葫芦和转基因烟草在不同磷浓度条件下培养的湿重无机磷含量以及转基因烟草不同生长时间的磷含量。第1天时水葫芦根部和叶子中的湿重磷含量受外界磷浓度影响大，1mMP条件下水葫芦叶子无机磷含量随着时间的增长而增加。随着磷浓度增加，烟草根中的无机磷含量越高，随着生长时间越长，转基因烟草叶子无机磷含量越高。在MS培养30和40天后，农杆菌侵染的烟草叶子中的总磷含量都比根部高。
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