摘要
芥菜是一种在我国南方地区广泛种植的十字花科芸薹属特色蔬菜，起源于中国且栽培历史悠久。芥菜的种类繁多，有叶用类、茎用类、根用类和薹用类等，目前可将其大致分为16个变种。芥菜的食用方式多样、营养丰富，可鲜食、可腌制加工，深受广大消费者和蔬菜加工企业的亲睐。随着消费者多样化需求日益增加，包括鲜食芥菜营养品质、功能性成分和加工芥菜的风味品质研究，因此，芥菜育种工作者致力于培育出优质、抗逆、适宜加工的芥菜新品种。细胞质雄性不育系(CMS)是十字花科蔬菜作物杂种优势利用中的重要途径，目前在十字花科蔬菜中应用最广泛的细胞质雄性不育系统主要有pol CMS、ogu CMS等。 芥菜细胞质雄性不育类型(hau CMS)是华中农业大学于1999年在芥菜型油菜中发现的一种新型细胞质雄性不育源，不育性稳定且败育彻底。通过杂交和回交育种技术，将油用芥菜型油菜雄性不育源转育到芥菜类蔬菜雄性不育系过程中，部分芥菜变种hau胞质雄性不育系存在结荚畸形、弯曲等方面的问题，影响了芥菜类蔬菜杂交种的制种产量，制约了芥菜hau胞质雄性不育杂交品种的应用推广。 本研究对不同芥菜变种的hau细胞质雄性不育系的结荚性状进行了田间调查，对结荚畸形的情况做出统计，并利用分子标记手段将现有芥菜变种材料进行遗传多样性分析，筛选出结荚性状优良的芥菜hau胞质雄性不育系材料;同时以结荚正常的芥菜材料作为对照，对芥菜hau胞质雄性不育系的花器官发育和花药败育进行细胞学观察，初步揭示了芥菜雄性不育系结荚畸形性状的形成机理;最后通过细胞融合技术对结荚畸形的芥菜雄性不育系进行芥菜品种改良，预期获得不育性稳定、结荚正常的芥菜类蔬菜雄性不育系。本研究结果将为芥菜hau胞质雄性不育系的品种改良提供不育资源和理论依据，加速芥菜hau CMS在十字花科蔬菜中的推广应用。主要研究结果如下: 1.芥菜类蔬菜的结荚形态学调查。对30份芥菜细胞质雄性不育系和29份相应的芥菜保持系的结荚形态的调查，通过观察可以看出29份芥菜保持系的结荚均表现为饱满、直立，而30份芥菜细胞质雄性不育系的结荚表现各异，部分雄性不育材料（如茎瘤芥等）的结荚跟保持系材料一样，饱满且直立，而部分不育系材料（如结球芥等）的结荚则在不同程度上均有扭曲畸形的表现。 2.芥菜类蔬菜雄性不育系的不育基因鉴定。对29份芥菜雄性不育系进行不育胞质类型鉴定，鉴定结果显示，有7份是芥菜ogu雄性不育系，其余23份均为芥菜hau胞质雄性不育系。结合结荚形态调查结果可以发现，芥菜ogu细胞质雄性不育系的结荚形态一致，均为直立饱满，没有畸形情况出现;芥菜hau细胞质雄性不育系结荚情况则参差不齐，其中有5份材料的结荚情况表现良好，基本上是直立饱满、畸形情况非常少，而另外的18份材料则在不同程度上均有结荚畸形情况，需要改良。 3.芥菜类蔬菜细胞质雄性不育系的结荚性状调查。对30份芥菜细胞质雄性不育系进行结荚性状的田间调查，从结荚畸形率来看，有11份材料的畸形率较低，在0-1％左右，而芥菜ogu CMS材料的畸形率均为0;从直立角果的每角果粒数来看，平均每角果粒数为13.0，每角果粒数最高的材料是17W153，数量最低的是17W159;从畸形角果的每角果粒数来看，平均每角果粒数为9.9，每角果粒数最高的材料是17W103，数量最低的是17W101。统计数据显示，芥菜ogu CMS的结荚性状优良，而芥菜hau CMS只有4份表现优异，且从结籽数量来看，结荚畸形会影响制种产量。 4.芥菜类蔬菜保持系的遗传多样性分析。通过SSR分子标记对29份芥菜保持系进行聚类分析，聚类结果显示，29份芥菜保持系材料的遗传相似系数介于0.6-1.0之间，在遗传相似系数0.74处将29份芥菜保持系分为6个类群:第一类是材料17W154;第二类是材料17W102和17W508;第三类是材料17W504;第四类是材料17W158和17W182;第五类是材料17W176;第六类则囊括了剩余的所有材料。 5.芥菜类蔬菜细胞质雄性不育系的细胞学观察。对芥菜ogu细胞质雄性不育系进行花器官发育和花药败育的细胞学观察，发现芥菜ogu细胞质雄性不育系花器官发育正常，花药从四分体后期开始败育，败育特征为绒毡层提前降解，随后小孢子完全降解，花药败育;对芥菜hau细胞质雄性不育系（结荚正常）进行花器官发育和花药败育的细胞学观察，发现雌蕊基本正常，雄蕊基本心皮化，个别没有心皮化完全的雄蕊在角隅处还留有一个药室发育，残留药室的败育在四分体时期开始，绒毡层细胞异常肥大且不降解，小孢子缺乏养分而降解，花药败育完全;对芥菜hau细胞质雄性不育系（结荚畸形）进行花器官发育和花药败育的细胞学观察，发现雄蕊均完全心皮化，且与雌蕊形成雌蕊-雄蕊嵌合体，雌蕊内胚珠数量较多，且心皮化的雄蕊内也着生胚珠，雄蕊的败育在雄蕊原基发生时即开始，不产生雄蕊原基而产生心皮组织，并以心皮状态继续生长发育。 6.芥菜类蔬菜hau胞质雄性不育系的细胞融合技术研究。通过细胞工程手段对芥菜结荚性状的改良进行初步的探究，使用原生质体化学融合的方式，探究出了适合芥菜原生质体化学融合技术的方法和条件，研究发现，以SCM溶液提取法配合蔗糖溶液分层提纯效果好，用配方为0.5％纤维素酶+0.1％果胶酶+0.2mmol/L甘露醇+80mmol/L CaCl2的酶解液遮光酶解14h后提纯，蔗糖提纯溶液配方为0.5M蔗糖+1mM MES，采用PEG化学融合法进行融合，融合液配方为15％PEG+60mMCaCl2+25mM甘露醇+10％DMSO，融合方式为将原生质体混合液滴于PEG融合液之上后暗培养而后稀释。通过以上能够获得大量可供后期培养的芥菜原生质体融合杂种。
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