摘要
异育银鲫(Carassius auratus gibelio)是我国主要的淡水养殖品种之一。由鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus2，CyHV-2)感染引起的鲫造血器官坏死症是一种严重的病毒性传染病，给水产养殖业造成了巨大的经济损失，开展鲫鱼抗病毒防御机制研究对其病毒性疾病的防控具有重要的现实意义。干扰素(Interferon，IFN)是一类重要的分泌型细胞因子，能够抑制病毒增殖和调节机体免疫应答，在先天性和适应性免疫中发挥着重要作用。目前，Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)已在多种硬骨鱼类中得到研究，但有关异育银鲫IFN-Ⅰ的研究还未深入开展。本研究克隆获得一种异育银鲫IFN-Ⅰ基因(CagIFNa)，完成了对该基因的鉴定和序列结构分析，分析了CagIFNa在体内和体外的表达模式，并对CagIFNa在鲫鱼脑细胞系(Gibel carp brain cell line，GiCB)中抵抗CyHV-2感染的抗病毒活性进行了研究。旨在进一步揭示鱼类先天性抗病毒感染机制，为鲫鱼疱疹病毒造血器官坏死症的有效防控奠定理论基础。主要结果如下: 1.CagIFNa的克隆和序列结构分析 基于RACE PCR技术，以异育银鲫肾脏组织总RNA为模板进行扩增，得到CagIFNa基因cDNA序列全长为724bp，预测ORF长度为552bp，可编码183个氨基酸。CagIFNa序列中存在两个保守的半胱氨酸残基(C1∶C24，C2∶C120)，N端含有一个长度为23个氨基酸的信号肽。氨基酸序列相似性分析表明，CagIFNa与鲤科鱼类IFN的相似性最高。系统发育树结果显示，CagIFNa与硬骨鱼类Ⅰ类IFN-Ⅰ家族的IFNa亚型基因聚为一支。 2.CagIFNa体内表达特征 荧光定量PCR检测结果显示:CagIFNa在健康异育银鲫被检测的9种组织中均有表达，并且肝脏、肠、脾脏和头肾中的表达水平相对较高。异育银鲫感染CyHV-2后，头肾中CagIFNa的表达量在12h、24h和48h与对照组相比显著下调，然而120h的表达量显著上调至对照组的6倍;脾脏中CagIFNa的表达量在感染后24h、48h和120h与相应对照组相比均显著下降。 3.Poly I∶C刺激和CyHV-2感染条件下CagIFNa体外时序表达模式 荧光定量PCR检测结果显示:poly I∶C刺激GiCB细胞后，细胞中CagIFNa的表达量从6h开始显著升高，12h达到峰值，为相应对照组的347倍，随后表达量下降但仍高于对照组;CyHV-2感染后，细胞中CagIFNa的表达量在6h显著上调，随后表达量逐渐下降，但在120h表达量显著上调并达到峰值，为对照组的10.7倍。 4.CagIFNa的抗病毒活性研究 构建真核表达质粒pCMV-HA-CagIFNa并转染GiCB细胞，western-blot检测结果显示:CagIFNa蛋白能够在GiCB细胞中实现过表达并分泌到细胞外。pCMV-HA-CagIFNa转染GiCB细胞，研究CagIFNa在细胞水平上的抗病毒能力，结果显示:CagIFNa能够显著减弱由CyHV-2感染引起的细胞病变效应，并且使病毒滴度在感染后24h、48h和120h分别比相应对照组下调6.8倍、18.6倍和69.2倍;同时，荧光定量PCR检测结果显示，过表达CagIFNa的细胞在感染CyHV-2后，病毒基因CTP、MCP和TK的表达量与对照组相比均显著降低。CagIFNa表现出显著的抑制病毒复制的能力。 5.CagIFNa激活IFN-Ⅰ系统相关基因表达的研究 荧光定量PCR检测结果显示:过表达CagIFNa的GiCB细胞在感染CyHV-2后，细胞中IFN-Ⅰ系统相关基因包括IRF3、IRF7、IRF9、STAT1、Mx1和PKR的表达量相较于对照组均显著上调。CagIFNa可以有效诱导IFN-Ⅰ系统相关基因的表达，促进宿主抗病毒免疫应答的激活。
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