摘要
FOXL2是叉头状转录因子超家族的成员之一，在卵泡颗粒细胞中表达，对卵巢分化、发育和维持起重要的调控作用。在本课题组前期的研究中发现，鸡FOXL2最早在E4.5天开始表达，暗示其在鸡性别决定和性腺分化过程中可能发挥重要调控作用，随后在成年鸡中，随着卵泡发育FOXL2在小白卵泡中低表达、在等级前卵泡颗粒细胞表达升高、在排卵前卵泡颗粒细胞再度升高，暗示在卵泡的发育过程中，FOXL2同样可能发挥重要的调控作用;为此本研究的主要目是研究FOXL2在卵泡颗粒细胞维持中的作用，以及研究异位表达FOXL2对鸡胚睾丸支持细胞影响。研究结果如下: 1.构建了具有较高过表达效率的pcDNA3.1-FOXL2过表达载体，DF-1细胞转染24h后通过定量PCR检查FOXL2的相对过表达效率达1200多倍。 2.转染pcDNA3.1-FOXL2载体后通过CCK8和ATP方法检测FOXL2对排卵前颗粒细胞(po-GC)增殖的影响。结果显示:转染pcDNA3.1-FOXL248h组的细胞活力显著低于pcDNA3.1组和空白组，表明过表达FOXL2抑制排卵前颗粒细胞增殖;转染48h过表达FOXL2组G1期的细胞比例显著升高，而S期和G2期细胞则显著降低以及凋亡第二和第三象限细胞比例显著性升高，说明过表达FOXL2可抑制po-GC的周期进展，促进细胞凋亡。 3.为进一步了解过表达FOXL2对po-GC的促凋亡机制，通过qPCR检测凋亡TNF-α/NF-KB和JNK/MAPK信号通路基因，结果发现:过表达FOXL2能显著上调TNF-α、TNFSF10、FADD、BAK1、DAB21P、MAP3K7、FAS、MAP3K5、C-JUN、MAPK8、MAPK9、CASP8和CASP10等促凋亡基因，推测过表达FOXL2对排卵前颗粒细胞的促凋亡作用，主要是通过激活了JNK/TNF-α信号通路。用细胞免疫荧光检测过表达FOXL2后p65的细胞定位，结果发现离体培养的po-GC不管过表达FOXL2与否，p65均入核表达，说明此次离体培养的po-GC自主激活了NF-KB细胞通路。 4.软件预测FOXL2是miR-1329-3p的靶基因。通过等级前颗粒细胞(ph-GC)和排卵前颗粒细胞，miR-1329-3p和FOXL2的相对定量表达模式分析，发现两者呈相反表达模式，初步推断FOXL2是miR-1329-3p的靶基因。双荧光素酶报告基因检测发现，miR-1329-3p能够与FOXL2CDS的种子序列结合，显著性抑制FOXL2CDS区域的报告基因活性。qPCR和Westem blot研究发现，在转染颗粒细胞中，miR-1329-3p过表达能显著抑制FOXL2mRNA及蛋白质的表达，同时抑制miR-1329-3p后的结果与过表达刚好相反。结果表明在颗粒细胞中，miR-1329-3p能通过靶向FOXL2CDS种子序列负调控FOXL2的表达。 5.在鸡睾丸支持细胞中进行FOXL2的过表达，利用放射性免疫的方法检测了细胞上清雌二醇(E2)、孕酮(P)和睾酮(T)的含量，发现E2浓度显著性上调，而P、T无显著性变化;定量PCR检测转染后性腺分化发育相关基因的表达，发现过表达FOXL2可引起睾丸分化或发育相关基因SOX9、DMRT1、STAT3表达量显著性下调，而卵巢发育相关的CYP19A1和WNT4、CTNNB1（即WNT4/β-catenin信号通路）基因显著性上调。为进一步分析WNT4/β-catenin信号通路在此过程中被激活的作用，构建了pcDNA3.1-WNT4和pcDNA3.1-CTNNB1过表达载体，发现过表达WNT4或CTNNB1，除了DMR T1不受影响，SOX9和STAT3表达量均显著下调，CYP19A1表达量显著性上调，这与FOXL2过表达作用基本一致，初步确定WNT4/β-catenin信号通路的激活同FOXL2发挥协同作用。过表达WNT4或CTNNB1后FOXL2和CTNNB1或WNT4的表达也显著性上调，这说明FOXL2，WNT4和β-catenin三者间存在互作关系。进一步分析过表达FOXL2是否是通过WNT4/β-catenin信号通路发挥作用，利用siRNA干扰β-catenin发现SOX9的表达量显著上升，FOXL2和WNT4、CYP19A1的表达量显著降低，而DMRT1和STAT3的表达无显著性变化;在过表达FOXL2同时敲低β-catenin发现，与单独过表达FOXL2组相比，共转染组SOX9的表达量显著性上调，CYP19A1表达量显著性下调，而DMRT1和STAT3表达量差异不显著，这说明过表达FOXL2对SOX9的抑制作用主要是通过WNT4/β-catenin信号通路，且该通路协同FOXL2激活CYP19A1的表达，但并非主要途径。 6.构建了鸡胚E4.5-E18.5性腺FOXL2和CTNNB1的表达谱，发现FOXL2呈雌性特异性表达，且E4.5开始表达，随日龄表达量逐渐升高;CTNNB1表达不呈显著性别趋势，E4.5开始表达，推测CTNNB1在睾丸发育中同样发挥重要作用。
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