摘要
栽培花生（Arachis hypogaea L.）是世界重要农作物之一，含有丰富蛋白质和油脂。地下害虫特别是蛴螬对其具有重大的危害，其根部及荚果受到啃食，严重影响花生品质，而普通的防治手段对其防治都有潜在的弊端，因此利用植物基因工程的方法进行绿色防治极为重要。而寻找高效的组织特异启动子，驱动外源靶基因在特定的组织中进行表达，具有重要意义。本研究基于前期克隆的根特异性启动子，对其进一步进行功能分析并验证，并利用根特异启动子驱动cry8-like基因在烟草中的表达，从而为抗蛴螬转基因作物的研制奠定理论基础。主要研究结果如下: (1)基于前期克隆得到1021bp的AhNramp1根特异性启动子，进一步分析其功能;对该启动子做5'端缺失分析，构建了两个截短启动子(796bp、746bp)与GUSPlus报告基因融合，得到16H796和16H746两个植物表达载体。通过根癌农杆菌介导，对烟草进行遗传转化，已获得卡那霉素抗性苗共20株。 (2)对人工合成启动子SRSP进行进一步功能分析，RT-PCR结果显示，SRSP启动子驱动的gus基因只在转基因烟草的根部转录。对其T1代转基因烟草进行整株苗GUS化学组织分析，染色结果合成启动子SRSP可驱动gus基因在烟草根部特异性表达，而叶片及叶脉处无基因的表达。 (3)对花生AhMtan启动子进行初步功能分析，对转化烟草的T1代植株GUS化学组织染色，结果启动子可使根部特异表达报告基因gus;并对转基因烟草根部石蜡切片，分别进行横切与纵切观察，显示gus基因在根部的维管柱与皮层表达，表皮几乎不表达，而AhMtan启动子仅含有的两种根调控元件ROOTMOTIFTAPOX1和OSE2ROOTNODULE，这种特性与这两种元件有关。 (4)分别构建由AhNramp1、AhMtan、SRSP启动子驱动的cry8-like基因表达载体，将重组质粒转入根癌农杆菌LBA4404中，利用农杆菌介导法对烟草进行遗传转化。经过PCR鉴定，获得6株阳性苗，为后续抗虫提供依据。 本研究对实验室前期获得的花生根特异性启动子AhNramp1、AhMtan和人工合成启动子SRSP启动子进行了进一步的功能验证，并利用其驱动对蛴螬有杀虫活性的cry-8like基因在烟草中的表达，为获得抗蛴螬的转基因花生奠定了基础。
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