摘要
早期胚胎发育研究是认知特定物种个体发生和发育规律的基础，对其机制解析为现代生物学和医学发展做出了巨大的贡献。目前，人类对其它哺乳动物早期胚胎发育规律的认知主要局限于小鼠等少数模式动物，这阻碍了生命科学研究成果在畜牧生产和医疗领域的应用。猪在畜牧生产和生物医学模型方面都具有重要价值，因此其是小鼠等小型模式动物之外研究热度较高的大型模式动物之一。胚胎细胞命运决定和分化是胚胎发育的基础，其调控机制是发育生物学重要的研究领域。内细胞团(Inner cell mass，ICM)和滋养层(Trophectoderm，TE)的形成是由哺乳动物胚胎发育的第一次细胞命运决定与分化决定的，也是哺乳动物特有的胚胎细胞分化过程。内细胞团的发育命运是形成胚体本身的全部组织细胞和胚外内胚层组织细胞，滋养层的发育命运是形成胎儿胎盘绒毛膜的外胚层组织细胞，在胚胎着床过程中发挥不可替代的作用。 体外培养体系是获得猪着床前胚胎的重要方法。然而，目前无法从现有的培养体系中获得高质量的胚胎。胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)被认为有益于体外胚胎发育，能够提高囊胚率及囊胚细胞数。然而由于其成分的复杂性以及未知性，FBS促进体外胚胎发育的作用机制以及后续发育能力仍然未知。这限制了FBS在猪胚胎体外培养中的应用。本实验在体外受精后第4天向培养液中添加10％FBS。结果表明，与对照组相比，添加FBS不会提高囊胚率，但是囊胚孵化率显著提高(33±6％vs19±12％;P＜0.05)。但4天添加FBS的胚胎具有明显内细胞团，并且ICM的细胞数以及ICM细胞占总细胞数的比率明显高于对照组，而且发现大部分囊胚可以在体外培养至第8天。此外，我们的研究证明，FBS能够通过激活ROCK(RhoA/Rho-kinase)信号通路从而促进猪胚胎体外发育。在体外培养过程中添加ROCK信号通路抑制剂Y-27632能够显著抑制囊胚的形成。添加FBS，能够在一定程度上补偿Y-27632造成的影响，获得囊胚。同时发现添加FBS培养后，猪囊胚中ROCK信号通路关键因子ROCK1和ROCK2的表达水平明显增加。免疫荧光实验也证明，磷酸化RhoA/Rho-kinase也在细胞核中明显的富集。这些结果表明，FBS能够通过激活ROCK信号通路促进猪早期胚胎体外发育，同时也为FBS在猪体外培养体系中的应用以及进一步研究其促进胚胎发育的机制奠定了基础。 Oct4（又称Oct3）由Pou5f1基因编码，是POU(Pit-Oct-Unc)家族的同源域转录因子，是多能性调控网络中的关键因子。在小鼠早期胚胎发育过程中，Oct4被认为是内细胞团的标记基因。实验室的早期研究表明，猪合子期胚胎敲低OCT4后，大部分胚胎会发育阻滞在8-细胞阶段。在研究中发现，在猪早期胚胎发育过程中，OCT4蛋白在猪囊胚的几乎所有细胞中均广泛表达。为了探究猪囊胚滋养层OCT4在植入前胚胎发育中是否具有功能，选取体外培养第5.5天的小腔囊胚，通过病毒感染特异性敲低滋养层中OCT4的表达(OCT4TE-KD)。在体外培养至第7天时，OCT4TE-KD囊胚的形态未发生任何明显地变化（直径:224±35μm vs247±29μm1）。为了检测TE中敲低OCT4对胚胎后续发育的影响，将第6天的OCT4TE-KD囊胚进行移植，移植后第2天冲取胚胎，对第8天胚胎进行检测。结果发现，OCT4TE-KD胚胎的形态发生明显的变化，直径小于对照组胚胎。OCT4TE-KD囊胚内细胞团与滋养层细胞数均显著低于对照组囊胚（183±58vs83±39;161±54vs73±35;P＜0.05）。细胞凋亡相关基因BCL2A1的表达量明显降低，TUNEL检测结果表明，OCT4TE-KD囊胚细胞发生严重的凋亡。移植后第3天获取第9天胚胎进行检测，发现胚胎直径仅为对照组胚胎的1/2，并且大量死亡。收集第6天OCT4TE-KD囊胚滋养层和第8天胚胎进行转录组测序分析，结果表明，特异性敲低猪滋养层中OCT4后，会引起转录组发生一定变化，发生凋亡，最后胚胎无法存活。 转录因子Nanog在维持小鼠和人胚胎干细胞的多能性中起重要作用，并且在小鼠胚胎发育中内细胞团的分化起重要作用。然而，关于猪NANOG的功能研究知之甚少。因此，针对NANOG在猪早期胚胎中的表达模式和功能，进行了初步研究。首先利用Q-PCR和荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)的方法，证明了NANOG mRNA在从猪1-细胞期到囊胚期胚胎中均有表达。NANOG蛋白在4-细胞胚胎细胞核中开始表达，随后表达量下降，仅在8-细胞胚胎的部分细胞中表达，然而在早期囊胚期和中期囊胚中基本检测不到NANOG蛋白表达。培养体系中添加FBS，将胚胎培养至第8天，发现NANOG蛋白仅在上胚层(Epiblast，EPI)中表达。为了探究NANOG在猪早期胚胎发育中的功能，分别对NANOG进行敲低和过表达。结果表明，MII期敲低NANOG，胚胎发育阻滞在8-细胞期，囊胚形成率显著降低（36±2％vs16±9％;P＜0.05）。在4-细胞期通过病毒感染对NANOG进行敲低，发现囊胚阶段没有上胚层的形成，即敲低NANOG影响猪囊胚内细胞团向上胚层分化。这说明NANOG在猪胚胎上胚层形成中是不可缺少的。另一方面，过表达NANOG虽然不影响胚胎卵裂，但同样影响囊胚的形成。这些结果为猪NANOG在多能性调控中的作用研究奠定了基础。
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