摘要
病原体在感染昆虫的过程中会激活昆虫的免疫系统。Cry毒素是一类能在靶标昆虫中肠形成孔道的杀虫蛋白，目前昆虫对Cry毒素的免疫应答机制仍不清晰。本研究从小菜蛾中肠cDNA中克隆得到小菜蛾参与免疫应答的关键基因(Plutella xylostella poly(U)-specific endoribonuclease homolog）。该免疫基因在小菜蛾感染病原体时表达上调，通过免疫反应保护小菜蛾。序列分析结果表明该基因开放阅读框全长1053bp，编码350个氨基酸，我们将其命名为PxEH。PxEH和NCBI上Plutella xylostella poly(U)-specific endoribonuclease（XM011563907.1）的同源性为97％。 将克隆得到的PxEH疫基因构建原核表达载体pGEX-4T-1/PxEH，在B121表达菌中表达得到以与GST标签形成融合蛋白的目的蛋白，分子量大小为66kDa，且表达量相对较高，经western blot实验验证为带有GST标签的目的蛋白。实验并优化了诱导PxEH免疫基因表达蛋白的条件，在25℃，IPTG终浓度0.2mmol/L条件下表达得到最多的PxEH免疫蛋白。通过GST琼脂糖柱纯化得到了带GST标签的PxEH免疫蛋白。这是一种小菜蛾基因原核表达得到的新型免疫蛋白。 为了研究该基因在Cry毒素杀虫过程中的作用，我们通过RNAi沉默PxEH基因的表达，前期实验先筛选小菜蛾延伸因子ef1α一个片段为内参基因。通过qPCR验证了小菜蛾的同源免疫基因的表达随小菜蛾摄取Cry蛋白而改变。刚摄入Cry蛋白1h后，小菜蛾的PxEH基因大幅上调至8倍多，随后随时间的增长仍处于上调水平，相对不明显。推测由于小菜蛾摄取了Cry毒素，开启了应激的免疫反应来保护自身，PxEH基因作为免疫基因参与这个过程而大幅上调表达。再随着时间的增长，小菜蛾的免疫基因上调量下降。 利用体外mega scrip RNAi kit试剂盒体外合成dsRNA，本研究优化了合成的dsRNA的量及dsRNA饲喂小菜蛾表达下调的最佳时长。结果显示只需0.5倍体积的dsRNA即可达到沉默小菜蛾PxEH基因的效果。推测dsRNA干扰小菜蛾时，存在一个类似PCR的扩增步骤。饲喂3h内RNAi免疫基因PxEH表达量下调显著，在0.4倍以下。dsRNA干扰3h内为最佳干扰时间，随着时间的增长，dsRNA容易降解导致无干扰基因表达的效果。 饲喂Cry2Ab蛋白和dsRNA进行杀虫活性测定，48h后统计死亡率，结果显示RNAi沉默小菜蛾免疫基因PxEH表达后，Cry2Ab蛋白对小菜蛾的毒杀作用提高，LC50由0.0103μg/ml降至0.0089μg/ml，RNAi小菜蛾免疫基因PxEH后，小菜蛾对Cry2Ab蛋白的敏感性提高，死亡率上升。 将该基因的表达RNAi沉默后，小菜蛾对Cry2Ab杀虫蛋白的敏感性提高，这也与预期的实验结果一致。本研究为RNAi沉默小菜蛾免疫基因PxEH从而提高Cry毒素对其杀虫毒力提供了实验基础。 本研究利用免疫荧光技术探究Cry蛋白在小菜蛾中肠的作用位点。实验结果显示，Cry蛋白与小菜蛾中肠的内外膜都有结合，推测内外膜上均有BBMV的存在。
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