摘要
浮萍是世界上最小的开花植物，总共有5个属，分为37个种。作为一种广泛分布且形态高度退化的高等植物，其基因组小，以无性繁殖为主，生长速度快，培养条件简单低廉。因此，浮萍既可以作为一种理想的模式材料，用于研究植物生长发育机理机制和基因功能等;也可以作为一种理想的植物生物反应器，通过基因工程的途径，将其改造为“分子农场”，再通过大规模培养生产具有高经济附加值的药用蛋白、工业酶、生物可降解塑料及其它次生代谢产物等。为更好地研究和利用浮萍资源，建立其稳定的遗传转化体系至关重要。 因此，本论文的主要研究目的是建立根癌农杆菌介导的稳定浮萍遗传转化体系，同时建立其稳定悬浮细胞系，并对决定遗传转化是否成功的关键材料胚性愈伤组织形成原因和标志性基因进行探索。最后利用该体系通过基因工程改造的方法，进行将浮萍作为生物反应器生产生物制剂方面的应用研究。研究内容和取得的主要结果如下: (1)本研究建立了一套完整的浮萍组织培养技术体系，成功的实现了Wolffia globose ZH0097,Lemna minor D0158,Lemna gibba M157,Lemna japonica ZH0036四个浮萍株系从叶状体脱分化为愈伤组织，愈伤组织再分化再生出完整植物的组织培养过程。整个流程只需要3个月左右，大大快于前人的报道，为后续浮萍遗传转化体系的建立和应用研究奠定了基础。 (2)本研究利用转录组测序技术，进行了胚性愈伤组织形成机理分析和标志性基因挖掘。通过测定叶状体、非胚性愈伤组织、胚性愈伤组织的基因表达情况，一方面，分析愈伤组织形成过程中的关键基因，发现生长素、细胞分裂素和油菜素甾醇信号通路加强可能是胚性愈伤组织繁殖迅速的内在原因，干细胞维持关键基因WUS的显著性高表达可能与胚性愈伤组织全能性的维持密切相关;另一方面，挖掘胚性愈伤组织特异表达基因，发现LEC1、LEC2、FUS3、WOX5、WOX12、LBD16以及其同源基因在胚性愈伤组织中特异性高表达，并利用qPCR的方法验证，确定基因LEC1(Lminor_005765)和LBD16(Lminor_007406)在胚性愈伤组织(Callus2)中表达量很高，显著高于前两个阶段，可以作为浮萍胚性愈伤组织特征标志基因。 (3)本研究通过探索和优化培养条件建立了稳定的浮萍悬浮细胞系。采用愈伤组织细胞振荡培养对其进行悬浮培养，并对影响悬浮细胞生长的激素添加浓度、酸水解酪蛋白添加浓度、pH、摇床转速、接种量等因素进行了研究，优化后悬浮细胞系的生长速率最高可达16.19g/L/d(FW)。本研究首次建立了稳定优良的浮萍细胞悬浮系，拓宽了浮萍研究的手段，为利用浮萍悬浮体系进行遗传转化研究提供了技术支持。 (4)本研究以诱导成功的四个浮萍株系胚性愈伤(Wolffia globose ZH0097，Lemna minor D0158，Lemna gibba M157，Lemna japonica ZH0036)和一个悬浮细胞系(Lemna minor D0158)为实验材料，采用根癌农杆菌介导法，开展了GUS报告基因转化及鉴定试验。成功建立了稳定的浮萍胚性愈伤组织和悬浮细胞遗传转化体系，为应用基因工程手段改造浮萍和开发其种质资源潜力提供研究技术支持。 (5)本研究采用成功建立的根癌农杆菌介导的浮萍遗传转化体系，通过过表达关键酶基因CYP710A11，收获了浮萍转基因再生株系，成功提高了浮萍药用物质豆甾醇的含量，也进一步证明了本研究所建立的遗传转化体系的可行性。 本研究首次报道了适用于多株系快速组织培养技术体系、胚性愈伤组织转录组分析和浮萍悬浮细胞系的建立，建立了稳定高效的浮萍遗传转化体系，并利用建立的遗传转化体系通过基因工程改造的方法，进行了将浮萍作为生物反应器生产生物制剂方面的初步应用研究。本研究为浮萍进一步资源化利用与开发奠定了基础。
NETL