摘要
研究目的： 1.明确肥大细胞在胃癌微环境中浸润情况及相关趋化机制 2.阐明胃癌微环境诱导肥大细胞脱颗粒的调控机制及其促瘤效应 3.明确胃癌微环境中肥大细胞的表型特征及其调控机制 4.阐明肥大细胞通过发挥免疫抑制功能介导胃癌进展的作用机制及其临床意义 研究方法： 1.肥大细胞在胃癌微环境中浸润情况及相关趋化机制 从胃癌组织(包括瘤内区、浸润区、癌旁区和非肿瘤正常胃组织区)中分离制备单细胞悬液，流式细胞术检测肥大细胞在不同部位的浸润情况，并用免疫组织化学方法检测肥大细胞在胃癌组织中的分布。 在胃癌组织中，检测肥大细胞上的趋化因子受体谱的表达情况。采用流式细胞术分选胃癌中原位肥大细胞，进行趋化实验，阐明肥大细胞在胃癌组织中浸润增多的产生机制。 2.胃癌微环境诱导肥大细胞脱颗粒的调控机制及其促瘤效应 肿瘤组织培养上清（TTCS）及非肿瘤正常胃组织培养上清（NTCS）刺激人脐带血来源的肥大细胞（hCBMC）1h，通过β-hexosaminidase的释放水平检测肥大细胞的脱颗粒程度。 采用基因芯片筛查胃癌组织中促炎细胞因子表达谱，并用对应的人重组细胞因子刺激肥大细胞系（LAD2细胞）1h，检测β-hexosaminidase的释放水平。 3.胃癌微环境中肥大细胞的表型特征及其调控机制 胃癌组织分离制备单细胞悬液，流式细胞术检测组织中浸润的肥大细胞的表型特征。免疫荧光染色检测胃癌中肥大细胞PD-L1的表达。用50%浓度的TTCS或NTCS刺激hCBMC24h；用20%、40%、80%浓度的TTCS刺激hCBMC24h；用50%浓度的TTCS刺激hCBMC6、12、24h，流式细胞术检测hCBMC上PD-L1的表达水平。 4.肥大细胞通过发挥免疫抑制功能介导胃癌进展的作用机制及其临床意义 分选肿瘤或非肿瘤正常胃组织中原位肥大细胞，在加或不加PD-L1(20μg/ml)中和抗体下，与胃癌患者外周血来源的CFSE标记的CD3+T细胞共培养5天。收集细胞进行流式细胞染色，检测T细胞的增殖及γ-干扰素（IFN-γ）的表达情况，并收集细胞共培养上清，ELISA检测上清中T细胞分泌的效应因子浓度。 研究结果： 1.肥大细胞在胃癌微环境中浸润情况及相关趋化机制的结果 1.1流式细胞术检测肥大细胞在组织不同部位的浸润情况，发现：晚期（Ⅲ+Ⅳ期）胃癌患者瘤内区的肥大细胞占白细胞比例（即肥大细胞百分比）为11.69%±0.65%，其浸润程度显著高于浸润区（5.53%±0.73%）、癌旁区（7.44%±0.42%）和非肿瘤正常组织区（5.68%±0.34%）。免疫组织化学染色得到一致的结果，统计发现：在随机一个低倍镜视野中，晚期胃癌患者瘤内区的类胰蛋白酶阳性肥大细胞数为90±6，其浸润数目显著高于浸润区（39±7）、癌旁区（33±4）和非肿瘤正常组织区（23±3）。 1.2瘤内浸润的肥大细胞高表达CXCR4，且其表达水平高于癌旁及非肿瘤正常胃组织中的肥大细胞。肿瘤组织及其组织培养上清（TTCS）中CXCL12的浓度分别为72.64±7.85pg/mg和547.0±91.41pg/ml，分别显著高于非肿瘤正常胃组织中CXCL12的浓度（35.11±3.97pg/mg）及其培养上清（NTCS）中CXCL12的浓度（293.5±36.32pg/ml）。趋化实验中，计数各组趋化到Transwell下室的肥大细胞数目，发现：TTCS和NTCS组中，趋化到下室的肥大细胞数分别为8275±701和4483±295，说明相较于NTCS，TTCS对肥大细胞有更强的趋化作用；在TTCS中加入CXCL12中和抗体及CXCR4中和抗体处理组中，趋化到下室的肥大细胞数目减少，分别为6367±521及5900±529，说明CXCL12中和抗体或CXCR4中和抗体可以拮抗TTCS对肥大细胞的趋化效应。以上结果提示CXCL12-CXCR4轴可介导肥大细胞向肿瘤微环境中募集。 2.胃癌微环境诱导肥大细胞脱颗粒的调控机制及其促瘤效应的结果 2.1TTCS与NTCS刺激肥大细胞，其β-hexosaminidase的释放水平分别为34.10%±2.33%和16.07%±1.61%，说明TTCS能够显著诱导肥大细胞发生脱颗粒活动。筛查诱导肥大细胞脱颗粒的物质，发现：ADM可以显著诱导肥大细胞发生脱颗粒，其β-hexosaminidase的释放水平达到27.25%±1.25%（空白对照组为9.17%±0.34%），且具有浓度依赖关系。当加入ADM受体拮抗剂AMA后，TTCS介导的肥大细胞β-hexosaminidase的释放水平由32.05%±2.02%降至18.86%±1.09%，脱颗粒活动受到显著抑制，表明TTCS中的ADM可诱导肥大细胞脱颗粒。 2.2信号通路研究中，TTCS刺激Wortmannin（PI3K信号通路抑制剂）预处理的LAD2细胞，其β-hexosaminidase的释放水平为16.95%±1.59%（DMSO处理组为38.36%±2.42%），其脱颗粒活动受到显著抑制。TTCS刺激LAD2细胞可以上调细胞中AKT的磷酸化水平；当TTCS中ADM被拮抗后，LAD2细胞中AKT磷酸化水平下调。以上结果提示，胃癌来源的ADM可以激活肥大细胞的PI3K-AKT信号通路，此通路在肥大细胞脱颗粒活动中发挥重要作用。 3.胃癌微环境中肥大细胞的表型特征及其调控机制的结果 3.1流式细胞术检测发现胃癌组织中肥大细胞PD-L1的表达水平显著高于癌旁组织和非肿瘤正常胃组织中的肥大细胞。相较于NTCS，TTCS可以更显著地上调肥大细胞上PD-L1的表达，且具有时间和剂量依赖关系。 3.2ELISA检测发现：肿瘤组织及TTSC中TNF-α的浓度分别为78.72±8.76pg/mg和345.4±36.14pg/ml，分别显著高于非肿瘤正常胃组织中TNF-α的浓度(42.83±4.34pg/mg)及NTCS中TNF-α的浓度(179.8±23.12pg/ml)。TTCS诱导肥大细胞上调PD-L1的表达，其效应可被TNF-α中和抗体拮抗，表明肿瘤来源的TNF-α在诱导肥大细胞上调表达PD-L1的过程中发挥重要作用。 4.肥大细胞通过发挥免疫抑制功能介导胃癌进展的作用机制及其临床意义的结果 4.1肥大细胞与T细胞在胃癌中的浸润程度呈显著的负相关。免疫荧光检测发现肥大细胞与T细胞在胃癌组织中相互接触。 4.2体外，胃癌及非肿瘤正常胃组织中原位肥大细胞与T细胞共培养，增殖的T细胞占总T细胞百分比分别为38.80%±5.14%及54.93%±5.09%，IFN-γ+T细胞占总T细胞百分比分别为5.93%±0.27%及12.67%±0.26%。以上结果说明，与正常胃组织中的肥大细胞相比，胃癌中浸润的肥大细胞可显著抑制T细胞增殖和IFN-γ的分泌。当胃癌来源的肥大细胞与T细胞的共培养体系中加入PD-L1中和抗体后，增殖的T细胞百分比为54.67%±3.19%，IFN-γ+T细胞百分比为9.17%±0.59%，胃癌来源的肥大细胞对T细胞的抑制作用被削弱，说明肥大细胞上PD-L1介导了其对T细胞的抑制作用。 4.3体内，构建荷瘤小鼠模型。TTCS诱导的条件肥大细胞（TCM）与T细胞共培养，并在培养体系中加入PD-L1中和抗体或同型对照抗体，腹膜注射于小鼠体内。注射了TCM+T细胞+同型对照抗体的处理组其小鼠的肿瘤生长迅速，其瘤体重量达1.135±0.094g，提示TCM抑制了T细胞的抗肿瘤功能；相比之下，TCM+T细胞+PD-L1中和抗体的处理组其小鼠瘤体明显缩小，其瘤体重量为0.523±0.024g，提示TCM对T细胞的抑制作用是由PD-L1所介导的。 研究结论： 1.肥大细胞在胃癌组织中浸润增多，此浸润增多的肥大细胞是通过CXCL12-CXCR4趋化通路向胃癌组织募集的。 2.肿瘤来源的ADM通过激活PI3K-AKT信号通路，诱导肥大细胞发生脱颗粒活动，此脱颗粒效应，在体外，促进胃癌细胞增殖，抑制胃癌细胞凋亡；在体内，促进瘤体的生长和肿瘤的进展。此效应可通过中和肥大细胞分泌的IL-17A来阻断。 3.肿瘤来源的TNF-α可通过激活NF-κB信号通路，上调肥大细胞PD-L1的表达。 4.在体外，肿瘤组织中浸润的原位肥大细胞可通过PD-L1抑制T细胞的增殖和其效应分子的分泌；在体内，TTCS诱导的条件性肥大细胞通过PD-L1抑制T细胞的功能，促进肿瘤的进展。此免疫抑制功能可通过阻断肥大细胞上的PD-L1逆转。 5.胃癌组织中浸润增多的肥大细胞与患者某些胃癌晚期临床指标呈正相关，且与胃癌患者不良的预后相关。 意义： 本文阐明了肥大细胞在胃癌中新的促瘤机制和免疫抑制作用，提示胃癌中浸润的肥大细胞在未来可能成为预测患者临床预后的重要指标。本文明确了肥大细胞通过脱颗粒活动释放IL-17A，发挥的促瘤效应；阐明了肥大细胞中TNF-α-PD-L1免疫抑制通路的调控机制及其介导的对T细胞抗肿瘤功能的抑制作用。总之，阻断胃癌中浸润的病理性肥大细胞分泌的促癌性炎症因子IL-17A或其表达的免疫抑制性分子PD-L1，均有希望成为防治胃癌进展的有效手段。
NETL