摘要
目的：本文以传统中药材白及（Bletilla striata）为材料，探讨重要信号分子水杨酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）及其抑制剂对白及主要次生代谢产物（phenols,dactylorhin A,4-hydroxybenzyl alcohol）合成积累改变，对抗氧化酶活、脯氨酸含量等抗逆指标的影响，并结合酚类与联苄类化合物等代谢产物合成的限速酶—苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL，EC.4.3.1.5）在不同胁迫处理下酶活的变化与各基因家族成员的组织表达特异性，筛选并克隆其根中候选主效PAL成员的cDNA全长序列，进行生物信息学分析与胁迫响应表达变化检测。 方法：（1）SA与SA抑制剂多效唑（PP333）、MeJA与MeJA抑制剂布洛芬（IBU）处理白及幼苗（CK对照组、SA处理组、SA+PP333处理组、MeJA处理组、MeJA+IBU处理组），通过检测不同处理浓度与时间点下各处理组中白及超氧化物歧化酶、过氧化氢酶（SOD、CAT）与丙二醛（MDA）及脯氨酸含量变化，筛选出SA和MeJA胁迫处理最适浓度。（2）采用HPLC方法检测SA与MeJA处理下白及次生代谢产物变化。（3）试剂盒检测SA与MeJA处理下白及总酚含量与PAL活性的变化情况。（4）利用Real-time PCR技术检测白及根、茎、叶中PALs家族成员的时空表达特异性，不同处理条件下PALs基因相对达量变化，筛选不同胁迫处理下PALs家族在药用部位根中显著表达的成员。（5）对筛选得到的白及根中PAL采用RT-PCR、RACE技术克隆获得BsPAL基因cDNA全长，Protparam、SOPMA、SWISS-MODEL等生物信息学软件分析其编码蛋白的理化特性、结构域等特征，DNAMAN、MEGA软件分别进行氨基酸多序列比对与系统进化分析。 结果：（1）不同浓度SA和MeJA处理白及幼苗24h时，SA（100μmol/L）和MeJA（100μmol/L）处理组中CAT、SOD酶活显著高于对照，具有较高的脯氨酸含量与较低的MDA水平，可作为后续胁迫处理浓度。（2）用SA、SA+PP333、MeJA、MeJA+IBU处理白及幼苗，结果表明SA处理下，白及总酚含量呈现先升高后降低的趋势，在24h时达到峰值。SA+PP333处理下也呈现出同样的趋势，但在48h时达到峰值，且在48h与72h时的总酚含量均显著高于SA处理。PAL酶活则是SA处理下在6h时达到峰值，随后逐渐下降。附加抑制剂PP333后酶活在24h达到峰值，随后下降，但与CK组的酶活具有显著性差异；MeJA处理下，白及中总酚含量和PAL酶活都显著高于CK组和共处理组。MeJA+IBU处理下总酚含量和PAL酶活变化低于MeJA处理但变化趋势相同。（3）SA和MeJA处理下，白及中对羟基苯甲醇含量48h＞120h时，同时也高于相应CK处理组，且含量变化趋势与总酚相同都是先增高后降低；而dactylorhin A的含量差异不大，其中SA处理48h最高。（4）不同PALs家族成员在白及不同组织中的表达情况表明，白及根中BsPAL1-5表达量均显著高于叶与茎，BsPAL4和BsPAL5基因表达量显著高于其他家族成员。MeJA与SA处理下，BsPAL1-5各成员间的表达量趋势不同，且成员间变化水平也具有差异，但从量上看BsPAL1-5相对表达量均为MeJA组＞SA组＞CK组，而PAL4表达量在两种处理下的各取样时间点都较高，可作为研究白及苯丙烷代谢途径的候选关键基因。（5）克隆得到的BsPAL4基因cDNA全长为2438bp，编码一条708个氨基酸组成的多肽，预测蛋白质相对分子质量为76.5kDa，等电点6.39；BsPAL5基因cDNA全长为2708bp，编码一条797个氨基酸组成的多肽，预测蛋白质相对分子质量为86.2kDa，等电点6.24。BsPAL4和BsPAL5都具有植物PAL酶的典型结构域和活性中心，不具有跨膜结构域，与铁皮石斛、蝴蝶兰的PAL基因亲缘关系最近。 结论：（1）SA和MeJA胁迫处理下，显示白及对SA和MeJA的不同响应模式。（2）外源SA和MeJA均能促进白及的重要次生代谢产物总酚,对羟基苯甲醇（4-hydroxybenzyl alcohol）积累，与dactylorhin A的积累无明显促进作用。（3）BsPALs基因家族成员具有组织特异性，其中BsPAL4在不同处理下及根中具有较高表达水平可能是根中的该基因家族响应胁迫应答元件。（4）克隆得到BsPAL4和BsPAL5基因在结构上具有PAL基因家族的典型结构特点，在进化上高度保守。
NETL