摘要
烫伤痛（Burn Injury Pain）在临床上非常普遍，给患者的身心健康造成很大危害。当皮肤受到伤害性高温热力刺激后，损伤局部组织分泌多种炎性因子或趋化因子，兴奋表皮和真皮层内的伤害性感受器，将伤害性信息传向脊髓、丘脑和皮层，造成感觉传导通路的神经元兴奋性上升，产生痛觉敏感化。 目前研究表明，脊髓背角小胶质细胞的激活在Ⅱ度和Ⅲ度烫伤造成的痛觉敏化中发挥了重要作用。鞘内持续注射小胶质细胞活性抑制剂米诺环素明显抑制背角小胶质细胞激活和P38MAPK（P38-mitogen activated protein kinases，p38-丝裂原活化蛋白激酶）磷酸化，缓解大鼠足跖皮肤Ⅱ度烫伤造成痛觉敏化。当大鼠足跖皮肤Ⅲ度烫伤后，背角COX-2（Cyclooxygenase-2，环氧合酶-2）、iNOS（Inducible nitric oxide synthase，诱导型一氧化氮合酶）以及NF-κB（Nuclear factor-κB，核转录因子-κB）磷酸化增强，炎症因子IL-1β（Interleukin-1β，白细胞介素-1β）和TNF-α（Tumour necrosis factor-α，肿瘤坏死因子-α）表达上调，提示脊髓背角的炎症反应也参与了烫伤痛的发生与维持。 研究报道，P2Y12和P2Y13受体表达在脊髓背角，然而目前尚不清楚在Ⅰ度浅烫伤的情况下，P2Y12和P2Y13受体激活是否可以通过促进脊髓背角小胶质细胞激活与表型转化，随后分泌IL-1β、IL-6（Interleukin-6，白细胞介素-6）、TNF-α、iNOS多种神经活性物质，促进大鼠足烫伤痛的发生或发展。 本实验采用在体和离体两个方面，综合RTFQ-PCR(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，实时荧光定量PCR)、ELISA(Enzyme-linked immuno sorbent assay，酶联免疫吸附)以及WB（Western blot，免疫印迹）技术，观察（1）在体状态下，P2Y12/P2Y13受体激活对足烫伤痛大鼠MWT（Mmechanical withdrawal threshold，机械缩足反应阈值）及脊髓背角小胶质细胞功能的影响；（2）P2Y12/P2Y13受体激活对培养的脊髓背角小胶质细胞极化标记物表达的影响。 目的： 1.探讨脊髓背角P2Y12/P2Y13受体参与大鼠烫伤痛的机制。 2.探讨P2Y12/P2Y13受体是否可调节培养的背角小胶质细胞ROCK-1、ROCK-2、P38MAPK、NF-κB以及极化标记物表达。 方法： 1.成年SD大鼠随机分5组（n=6）：假烫伤组(sham)、烫伤模型+vehicle组(烫伤+鞘内注射0.005%DMSO生理盐水)、MRS2395处理组(烫伤+鞘内注射MRS2395100nmol/L)、MRS2211处理组（烫伤+鞘内注射MRS2211100nmol/L）、MRS2395和MRS2211联合处理组（烫伤+鞘内注射MRS2395+MRS2211，剂量均为100nmol/L）。大鼠右后肢足跖皮肤在85℃条件下，1000g力持续5s，造成Ⅰ度烫伤（病理切片证实），24h后机械痛阈明显下降认为造模成功。在大鼠烫伤前2h、烫伤后第5、11、23和47h鞘内注射MRS2211（100nmol/L，20ul）或MRS2395（100nmol/L，20ul）或等体积0.005%DMSO生理盐水。在每次给药后1h测定大鼠MWT；烫伤后24h，取脊髓腰膨大（L4-6）背角组织，RTFQ-PCR检测Iba-1、IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS、CD86、Arg-1和CD206在mRNA水平表达；ELISA检测IL-1β、IL-6和TNF-α含量；WB观察iNOS、Arg-1、ROCK-1、ROCK-2、P38MAPK和NF-κBp65表达。 2.离体培养3天内新生SD乳鼠脊髓背角小胶质细胞，接种六孔板（5×107/孔），培养48h。分组：（1）对照组（加单纯DMEM高糖培养基）；（2）ADPβS处理组，加ADPβS（10μmol/L），作用3h；（3）MRS2395+MRS2211处理组，MRS2395（10μmol/L）+MRS2211（10μmol/L）预处理20min，加入ADPβS（10μmol/L），作用3h后收集细胞，WB检测iNOS、Arg-1、ROCK-1、ROCK-2、P38MAPK和NF-κBp65表达。 结果： 1.机械痛阈测定显示，与假烫伤组相比，足烫伤后6h，大鼠即出现MWT明显下降，持续24h处于较低水平，差异具有统计学意义（P＜0.01），但48h后MWT明显回升，与假烫伤组相比，不具有统计学意义。与烫伤组相比，单独鞘内注射MRS2395或MRS2211处理后MWT有所回升（12h：P＜0.05；24h：P＜0.01）；鞘内联合注射MRS2395和MRS2211后，其MWT回升更为明显（12h，24h：P＜0.01）。 2.PCR结果显示，与假烫伤组相比，烫伤24h时大鼠脊髓背角Iba-1、IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS和CD86在mRNA水平表达明显上调，差异具有统计学意义（P＜0.01），而Arg-1和CD206mRNA无明显变化。与烫伤组相比，单独鞘内注射MRS2395或MRS2211仅部分抑制烫伤引起的脊髓背角Iba-1、IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS和CD86mRNA表达上调（P＜0.05），但Arg-1和CD206mRNA表达有所上调（P＜0.05）；MRS2395和MRS2211联合鞘内注射几乎完全阻断烫伤引起的脊髓背角Iba-1、IL-6、TNF-α、iNOS和CD86mRNA表达上调（P＜0.01），仅部分阻断IL-1β表达上调（P＜0.05），同时Arg-1和CD206mRNA表达明显上调（P＜0.01）。 3.ELISA结果显示，假烫伤组大鼠脊髓背角，IL-1β、IL-6和TNF-α含量均处于较低水平。与假烫伤组相比，烫伤24h时背角IL-1β、IL-6和TNF-α含量明显增多，差异具有统计学意义（P＜0.01）。单独鞘内注射MRS2395或MRS2211仅部分抑制烫伤大鼠脊髓背角IL-1β、IL-6和TNF-α含量上升，与烫伤组相比，具统计学意义（P＜0.05）。MRS2395和MRS2211联合鞘内注射几乎完全阻断烫伤引起的脊髓背角IL-6和TNF-α含量上升（P＜0.01），仅部分阻断IL-1β含量上升（P＜0.05）。 4.WB结果显示，与假手术组相比，烫伤大鼠脊髓背角iNOS（小胶质细胞M1型特异性标记物）及ROCK-1、ROCK-2和P38MAPK表达上调（P＜0.05），同时，NF-κB表达明显上调（P＜0.01），而Arg-1（小胶质细胞M2型特异性标记物）表达未见明显变化。与烫伤组相比，MRS2395和MRS2211联合鞘内注射部分阻断烫伤引起的脊髓背角iNOS、ROCK-1、ROCK-2、P38MAPK表达上调（P＜0.05），几乎完全阻断NF-κBp65表达上调（P＜0.01），同时Arg-1表达明显上调（P＜0.01）。 5.在离体实验中，WB结果显示，与对照组相比，培养的大鼠脊髓背角小胶质细胞iNOS、ROCK-1、ROCK-2和P38MAPK表达上调（P＜0.05），同时，NF-κBp65表达明显上调（P＜0.01），而Arg-1表达未见明显变化。与ADPβS处理组相比，MRS2395和MRS2211联合处理部分阻断ADPβS引起的脊髓背角iNOS、ROCK-1、ROCK-2和P38MAPK表达上调（P＜0.05），几乎完全阻断NF-κBp65表达上调（P＜0.01），同时Arg-1表达明显上调（P＜0.01）。 结论： 1.脊髓背角P2Y12/P2Y13受体激活参与了足烫伤导致的大鼠机械痛敏，鞘内注射MRS2395和/或MRS2211通过抑制脊髓背角P2Y12/P2Y13受体激活发挥镇痛效应。 2.在培养的脊髓背角小胶质细胞，P2Y12/P2Y13受体激活可能通过激活ROCK/P38MAPK/NF-κB通路导致小胶质细胞M1极化。
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