摘要
本文主要从以下几个部分展开论述： 第一部分：砷暴露与2型糖尿病的病例对照研究 目的： 探讨砷暴露与糖尿病的关联性及不同砷暴露水平人群血清中GSK-3β表达水平。 方法： 本研究在贵州省安龙县开展了燃煤砷暴露与糖尿病的1：1年龄和性别的病例对照研究。2型糖尿病病例组和正常对照组各232人。通过一对一问卷调查收集研究对象的人口学特征，经专业护士人员采集空腹血和收集晨尿。全自动生化分析仪检测血清中空腹血糖(Fsteing blood glucose,FBG)、总胆固醇(Total Cholesterol,TC)、甘油三脂(Triglyceride,TG)、低密度脂蛋白(Low-densitylipoprotein,LDL)、高密度脂蛋白(High density lipoprotein,HDL)、肌酐(Creatinine,CRE)、谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、白蛋白(Albumin,ALB)等生化指标。原子荧光分光光度计检测尿液和全血中砷含量，以尿砷含量定义砷暴露情况，我国尿砷安全指导限值为32μg/L，将尿砷水平大于32μg/L作为人群既往有砷暴露，低于32μg/L作为非砷暴露。ELISA检测人群对照组(Control)、2型糖尿病组(T2DM)、砷暴露未患2型糖尿病组(As-Control)和砷暴露患2型糖尿病组(As-T2DM)样本血清GSK-3β和磷酸化糖原合成酶激酶-3β(Phosphorylated glycogen synthase kinase-3β,P-GSK-3β)，以P-GSK-3β/GSK-3β比值表示GSK-3β蛋白活性。采用logistic回归，计算砷暴露和糖尿病之间的比值比(Odds Radio,OR)和95%置信区间(Confidence interval,CI)，分析砷暴露和糖尿病发病风险的关联性。亚组分析探讨砷暴露和糖尿病潜在的效应修饰因素。 结果： 砷暴露和糖尿病的单因素logistic回归结果中，砷暴露与糖尿病发病高风险显著相关(OR=2.09,95%CI：1.44~3.03)。经多个模型调整了混杂因素，砷暴露与糖尿病发病高风险仍显著相关(OR=2.01,95%CI：1.4~3.0)。不同尿砷水平与糖尿病的关联性不同，高尿砷水平患糖尿病的风险更大(OR=2.68,95%CI：1.45~4.80)。进一步亚组分析发现在体质指数(Body mass index,BMI)≥25kg/m2，TG≥1.7mmol/L，ALT＞40U/L，CRE＞97μmol/L的人群中砷暴露与糖尿病发病风险的关联强度更加明显(Pinteraction＜0.05)。ELISA结果显示，T2DM-As组P-GSK-3β/GSK-3β比值的中位数为0.22，低于Control、T2DM、Control-As组，T2DM-As组GSK-3β蛋白活性高于Control、T2DM、Control-As组(P＜0.05)。 结论： 砷暴露可显著增加糖尿病的发病风险，这可能与砷进入体内后GSK-3β活性增强有关。 第二部分GSK-3β在砷致糖代谢紊乱中的作用 目的： 鉴于人群实验发现砷暴露与GSK-3β蛋白活性存在相关性，及GSK-3β对糖尿病发生、发展有很重要的关系，所以本研究建立砷致糖代谢紊乱大鼠模型，探究GSK-3β在砷致糖尿病中的可能作用。 方法： 选择健康清洁级SD雄性大鼠60只，体重200±20g，采用随机数字表法将其分为6组，通过饮水砷染毒；Control组，5mg/kgAs组、10mg/kgAs组、15mg/kgLicl组、5mg/kgAs+15mg/kgLicl组、10mg/kgAs+15mg/kgLicl组，每组10只。每周检测大鼠空腹血糖两次；至第13周，空腹抽取眼眶血检测大鼠糖化血红蛋白和胰岛素；与对照组比较，各染砷组鼠出现糖代谢指标差异后，15mg/kgLicl组、5mg/kgAs+15mg/kgLicl组、10mg/kgAs+15mg/kgLicl组大鼠腹腔隔天注射GSK-3β抑制剂(15mg/kgLiCl)。15周后处死大鼠，HE染色镜下观察大鼠肝脏组织病理学变化；原子荧光光度计检测血、尿、各组织、毛发砷含量；ELISA检测大鼠血清胰岛素；计算各组大鼠胰岛素抵抗指数和胰岛素敏感指数；RT-qPCR检测大鼠肝脏组织GSK-3βmRNA表达水平，Western Blot检测大鼠肝脏GSK-3β、P-GSK-3β蛋白表达水平。以P-GSK-3β/GSK-3β比值表示GSK-3β蛋白活性。 结果： 1.大鼠砷暴露13周后，与Control组比较，各染砷组大鼠空腹血糖增加(P＜0.05)，各染砷组大鼠空腹糖化血红蛋白增加(P＜0.05)，各染砷组大鼠空腹胰岛素均降低(P＜0.05)。与Control组比较，各染砷组大鼠胰岛素抵抗指数增加(P＜0.05)，各染砷组大鼠胰岛素敏感指数降低(P＜0.05)。 2.大鼠砷暴露15周且15mg/kgLicl组、5mg/kgAs+15mg/kgLicl组和10mg/kgAs+15mg/kgLicl组腹腔注射GSK-3β抑制剂(LiCl)两周后，与Control组比较，5mg/kgAs组、10mg/kgAs组大鼠血糖仍增加(P＜0.05)；5mg/kgAs+15mg/kgLicl组、10mg/kgAs+15mg/kgLicl组大鼠血糖与对照组无差异(P＞0.05)。5mg/kgAs组、10mg/kgAs组大鼠空腹胰岛素低于Control组(P＜0.05)，5mg/kgAs+15mg/kgLicl组空腹胰岛素高于5mg/kgAs组(P＜0.05)，10mg/kgAs+15mg/kgLicl组空腹胰岛素高于10mg/kgAs组(P＜0.05)。 3.与Control组比较，5mg/kgAs组、10mg/kgAs组大鼠胰岛素抵抗指数增加和胰岛素敏感指数降低(P＜0.05)，5mg/kgAs+15mg/kgLicl组胰岛素抵抗指数组低于5mg/kgAs组；5mg/kgAs+15mg/kgLicl胰岛素敏感指数组高于5mg/kgAs组；10mg/kgAs+15mg/kgLicl胰岛素敏感指数组高于10mg/kgAs组。 4.与Control组比较，10mg/kgAs、10mg/kgAs+15mg/kgLicl组大鼠肝脏、脾脏、肾脏和胰腺的脏器系数增大(P＜0.05)，5mg/kgAs、5mg/kgAs+15mg/kgLicl组大鼠肾脏的脏器系数增大（P＜0.05）。 5.与Control组比较，10mg/kgAs、10mg/kgAs+15mg/kgLicl组大鼠肝脏结构异常，肝细胞索排列紊乱伴有水肿，汇管区可见明显的炎性细胞浸润。 6.与Control组比较，5mg/kgAs和10mg/kgAs组大鼠肝脏GSK-3βmRNA表达水平增高（P＜0.05），5mg/kgAs+15mg/kgLicl和10mg/kgAs+15mg/kgLicl组大鼠肝脏GSK-3βmRNA表达水平无差异(P＞0.05)；与10mg/kgAs组比较，10mg/kgAs+15mg/kgLicl组GSK-3βmRNA表达水平降低（P＜0.05）。 7．各组大鼠GSK-3β蛋白水平无明显变化。与Control组比较，5mg/kgAs和10mg/kgAs组大鼠肝脏Ser9-GSK-3β蛋白水平降低(P＜0.05)，5mg/kgAs+15mg/kg Licl和10mg/kgAs+15mg/kgLicl组大鼠肝脏Ser9-GSK-3β蛋白水平无差异(P＞0.05)；与5mg/kgAs组比较，5mg/kgAs+15mg/kgLicl组大鼠Ser9-GSK-3β蛋白水平增高(P＜0.05)；与10mg/kgAs组比较，10mg/kgAs+15mg/kgLicl组大鼠Ser9-GSK-3β蛋白水平增高(P＜0.05)。 8.与Control组比较，5mg/kgAs和10mg/kgAs组Ser9-GSK-3β/GSK-3β的比值降低，GSK-3β蛋白活性增高(P＜0.05)，5mg/kgAs+15mg/kgLicl和10mg/kgAs+15mg/kgLicl组大鼠肝脏Ser9-GSK-3β/GSK-3β的比值无差异(P＞0.05)。与5mg/kgAs组比较，5mg/kgAs+15mg/kgLicl组Ser9-GSK-3β/GSK-3β的比值增高，GSK3β蛋白活性降低(P<0.05)。与10mg/kg比较，10mg/kgAs+15mg/kgLicl组Ser9-GSK-3β/GSK-3β的比值增高，GSK3β蛋白活性降低(P＜0.05)。 结论： 砷可能通过抑制GSK-3β的Ser9位点磷酸化，增强GSK-3β蛋白活性，进而发生胰岛素抵抗和/或胰岛素分泌减少，血糖升高，引起糖代谢紊乱。
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