摘要
目的： 为明确IL-17A/IL-17RA在非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)进展中的作用，探讨IL-17A/IL-17RA与NSCLC临床恶性表型的相关性；IL-17A/IL-17RA对NSCLC细胞增殖、侵袭、迁移等恶性生物学表型的影响；初步探讨IL-17A/IL-17RA表达参与的细胞调控通路，为IL-17A/IL-17RA在非小细胞肺癌的治疗中的潜在价值提供理论基础。 方法： 1．利用免疫组织化学染色检测IL-17A，IL-17RA及MMP-9在肿瘤组织及相应癌旁正常组织中的表达；根据免疫组化染色评分结果，统计分析IL-17A，IL-17RA及MMP-9表达水平与NSCLC患者临床病理学特征之间的相关性；收集NSCLC患者的随访资料，采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线。 2．通过蛋白质印迹法（Western blot）检测不同非小细胞肺癌细胞系中IL-17RA蛋白的内源性表达量差异，筛选出高表达IL-17RA的细胞株和低表达IL-17RA的细胞株。设计合成携带GFP的干扰IL-17RA表达的慢病毒包装载体，同时设计合成携带GFP的IL-17RA表达慢病毒包装载体，选择IL-17RA表达高的细胞株H1975通过慢病毒感染建立干扰IL-17RA细胞株；选择IL-17RA低表达的细胞株A549通过慢病毒感染建立表达IL-17RA细胞株。 3．通过MTT法绘制生长曲线检测IL-17A/IL-17RA对NSCLC细胞生长、增殖的影响；通过划痕实验及Transwell迁移实验，检测IL-17A/IL-17RA对NSCLC迁移能力的影响；通过Transwell小室侵袭实验，检测IL-17A/IL-17RA对NSCLC细胞侵袭能力的影响。 4．通过Western blot检测IL-17A/IL-17RA对p38MAPK通路相关靶蛋白p38，p-p38的表达的影响；通过加入信号通路抑制剂阻断信号通路，观察IL-17RA过表达细胞株在抑制p38MAPK通路后，对NSCLC细胞增殖及侵袭迁移的影响。 5．通过Western blot验证，检测IL-17A/IL-17RA对MMP-2，MMP-9的表达的影响；并通过加入p38MAPK信号通路抑制剂观察IL-17A/IL-17RA是否通过此信号通路调节MMP-2，MMP-9的表达。 结果： 1．IL-17A，IL-17RA及MMP-9在NSCLC中高表达且同预后相关 在60例非小细胞肺癌组织中，IL-17A阳性表达共46例，阳性率76.7%，与非小细胞肺癌患者的pTNM分期有关，差异具有统计学意义(x2=12.179，P=0.000），阳性表达IL-17A的患者较阴性表达的患者总生存期（Overall survival，OS）差，差异具有统计学意义(x2=4.599，P=0.032）；MMP-9阳性表达共48例，阳性率80.0%，MMP-9的阳性表达与pTNM分期有显著性差异(x2=24.859，P=0.000），阳性表达MMP-9的患者较阴性表达的患者OS差，差异具有统计学意义(x2=3.8872，P=0.049)。在139例临床标本中，IL-17RA阳性表达率54.7%(76/139)，并与分化程度(P=0.040)、肿瘤大小（P=0.034)及肿瘤分期（P=0.018）呈正相关；高表达IL-17RA的患者OS（P=0.0254）及无病生存期（Disease-free survival，DFS）（P=0.0398）均较差。 2．IL-17A/IL-17RA促进NSCLC细胞侵袭迁移 PCR及Western blot检测结果显示：IL-17RA在本实验中所用3株NSCLC细胞株（A549，H157及H1975）中均表达，其中A549表达最低，H1975表达最高。IL-17A可增强H1975及A549细胞迁移和侵袭能力，而IL-17A对NSCLC细胞的增殖能力无明显影响；而过表达IL-17RA后，A549细胞侵袭迁移能力明显增强；干扰IL-17RA表达后，H1975细胞侵袭迁移能力明显受到抑制；然而，IL-17RA对NSCLC细胞的增殖能力无明显影响。 3．IL-17A/IL-17RA通过激活下游p38MAPK信号通路促进NSCLC细胞恶性表型 Western blot检测结果显示：过表达IL-17RA后，A549细胞中p38的磷酸化水平明显升高；而干扰IL-17RA后，H1975细胞中p38的磷酸化水平明显降低。此外，对于内源性高表达IL-17RA的细胞株H1975和过表达IL-17RA的A549细胞中加入p38MAPK信号通路抑制剂SB203580后，细胞侵袭及迁移能力同样受到抑制。 4．IL-17A/IL-17RA通过p38MAPK信号通路上调下游作用分子MMP-2、MMP-9促进NSCLC细胞恶性表型 Western blot检测结果显示：在IL-17A的刺激下，H1975细胞及A549细胞中MMP-2及MMP-9表达水平均明显升高。A549细胞过表达IL-17RA后，细胞中MMP-2、MMP-9的表达水平明显升高；而干扰IL-17RA后，H1975细胞中MMP-2、MMP-9的表达水平明显降低。此外，内源性高表达IL-17RA的H1975细胞以及过表达IL-17RA的A549细胞加入p38MAPK信号通路抑制剂SB250380后，细胞侵袭迁移能力明显受到抑制；进一步发现，当加入p38MAPK信号通路抑制剂SB250380后，IL-17A/IL-17RA介导的MMP-2、MMP-9的表达水平均明显下降。 结论： 1．IL-17A，IL-17RA及MMP-9在NSCLC中呈高表达，IL-17A，IL-17RA及MMP-9阳性表达的NSCLC患者其预后均较差。 2．体外实验证实IL-17A/IL-17RA可促进NSCLC细胞侵袭及迁移能力。 3．IL-17A/IL-17RA可通过激活NSCLC细胞中的p38MAPK信号通路上调MMP-2，MMP-9表达，从而影响非小细胞肺癌恶性生物学行为，最终促进非小细胞肺癌进展。
NETL