摘要
吡嗪酰胺（Pyrazinamide，PZA）是抗结核一线药，由于使用不当等原因造成耐药性，而pncA是PZA耐药发生的相关基因。pncA突变会导致酶活性的降低或丧失，但是并不是所有的突变都会导致酶活性的改变，所以pncA多态性位点对于耐药基因检测具有重要的意义。本论文通过蛋白表达，用Wayne法对PZase进行酶活性的测定，对本实验已有的PZA耐药基因检测体系进行修改，加以完善。 第一章中，介绍了结核病的背景，结核病的耐药情况及PZA耐药情况。比较了常见的PZA耐药的诊断方法，最后提出了本论文的研究目的、内容和意义。 第二章中，介绍了实验方法和材料。包括用不依赖连接反应克隆技术(ligation independent cloning，LIC)构质粒，蛋白表达，PZase酶活性的测定，还有用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR，QPCR)进行pncA启动子区域-11位点突变后表达量的实验等。 第三章中，介绍了实验的结果。用LIC克隆技术构建了75个质粒，，均用于蛋白表达。通过酶活性测定，大部分pncA突变的酶活性是降低或丧失，其中Ile6Leu,Thr47Ala,Lys48Glu,Pro54Pro,Ser65Ser,Tyr99Asp,Thr114Met是显示野生型的酶活性，将其确定为pncA多态性位点。在已有的检测体系上进行探针修改，更改后的体系最低检出量为50copies/test，具有良好的特异性和灵敏度。体系与药敏试验结果相比，灵敏度为75.89％，特异性为96.00％，与药敏的一致率为85.38％;与测序结果一致率为98.58％。
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