摘要
痛风是由尿酸盐晶体沉积于人体组织或关节周围引起的一种风湿性疾病，多由体内嘌呤代谢紊乱、尿酸含量过高等引起。针对内源性代谢物建立有效的分析手段，有助于人们深入探究生命体系的复杂代谢规律。本课题将靶向和非靶向代谢组学手段相结合，分别建立人尿液中痛风相关代谢物的快速分析方法和尿液非靶向全谱代谢组学分析方法，并应用于痛风代谢标志物的筛查，具体内容如下: 1、基于超高效液相色谱-紫外，四极杆-飞行时间质谱(UHPLC-UV-Q-TOF-MS)技术建立人尿液中11种痛风相关代谢物的分析方法，包括肌酸酐、尿酸、腺嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤、脱氧腺苷、腺苷、肌苷、鸟苷和黄苷。其中，肌酸酐含量是肾功能的重要指标，并可用于校正不同尿液样本之间的浓度差异。通过优化样品前处理和液相色谱分离条件，最终确定采用3倍尿液体积的甲醇去除少量蛋白，并使用ACE Excel2AQ(2.1×150mm，2μm)水性色谱柱分离目标化合物。优化后的色谱条件为:柱温40℃，流速0.3mL/min，流动相为0.01％甲酸(A)和乙腈(B)，梯度洗脱，检测波长为240nm，质谱在正离子模式(ESI+)下运行。除利用相应标样指认色谱峰外，还采用目标二级质谱(Targeted-MS/MS)对目标物进行碎片分析，根据特征碎片离子计算合理的中性丢失，显著提高鉴定的准确性和方法的专属性。 2、以人工合成的替代尿液Urisub为基质进行方法学验证。结果表明，该方法线性良好(R2≥0.9944)，动态范围较宽;准确性和精密度良好（准确性RE≤13.1％，日内精密度RSD≤9.1％，日间精密度RSD≤14.0％）;回收率较高(90.3％-109.6％，RSD≤8.0％);基质效应影响小(85.3％-110.5％，RSD≤9.7％);不同环境下样品较稳定(稳定性RE≤14.3％)。将该方法应用于15例急性痛风病人、15例慢性痛风病人和15例健康人尿液的比较分析，筛选潜在的嘌呤标志物。利用t检验结合主成分分析(PCA)，最终筛查出腺嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、腺苷、肌苷、黄苷和尿酸可作为不同分期痛风疾病的潜在标志物，并探讨其含量的变化规律。 3、将UHPLC-Q-TOF-MS技术用于不同分期痛风疾病的非靶向全谱代谢组学研究。对26例急性痛风病人、31例慢性痛风病人和32例健康人的尿液进行潜在代谢标志物的寻找。肌酸酐峰面积用于校正尿液样本的浓度差异。通过正交偏最小二乘-判别分析(OPLS-DA)得出重要变量投影(VIP)值，筛选出符合条件的差异性代谢物，并利用t检验分别找出不同分期痛风的潜在代谢标志物。利用人类代谢组数据库(HMDB)及Targeted-MS/MS，定性鉴定出18种潜在的痛风标志物。受试者工作曲线(ROC)用于诊断的准确性分析，根据受试者工作曲线下面积(AUC)确定代谢标志物的准确性和诊断价值。与靶向代谢组学相比，非靶向代谢组学有助于寻找更多不同种类的代谢标志物，以便深入理解痛风的发生发展过程。
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