摘要
华贵栉孔扇贝（ChlamysnobilisReeve）是我国南方重要的海水养殖贝类，具有生长快、周期短、营养丰富、味道鲜美等特点。华贵栉孔扇贝“南澳金贝”是本课题组经多代选育培育的国审水产新品种，外观金黄、富含类胡萝卜素、抗逆性强、养殖效益高。自育成以来，就备受养殖者和消费者的青睐。目前，已在我国南方海区广泛养殖。 本实验室前期工作表明，一些关键基因，如SRB-like-3,StAR-like-3等参与了“南澳金贝”体内的类胡萝卜素富集。为进一步解析这些关键基因的功能，本研究采用三代测序获得“南澳金贝”全长转录组，并结合二代测序获得“南澳金贝”（金色扇贝）与褐色扇贝的差异转录本。然后，通过对含SRB-like-3基因的BAC克隆载体进行测序获得其基因组结构，利用染色体步移技术获得启动子序列。最后，通过类胡萝卜素结合实验验证SRB-like-2/3的重组蛋白功能，进一步利用免疫共沉淀对SRB-like-3蛋白的体内互作蛋白进行筛选，并对其互作蛋白StAR-like-3开展RNAi实验以探讨StAR-like-3基因在金色扇贝富集类胡萝卜素过程中的作用。主要研究结果如下： 1.转录组分析：金色扇贝的全长转录组共获得26,237条非冗余序列，其中21,030条转录本获得注释信息，共有6,032条lncRNA转录本被预测到，并且还发现了227个可变剪切事件；对金色扇贝和褐色扇贝5种不同组织的转录本进行差异分析后共获得9,263条差异转录本，其中8,422条转录本获得注释信息，对差异转录本进行KEGG通路富集分析后发现，与类胡萝卜素富集相关的Lysosome通路在性腺、外套膜及肠道中得到均显著性富集；Fattyaciddegradation通路在性腺中也得到显著性富集。此外，一些与类胡萝卜素富集相关的基因在金色扇贝的组织中具有显著高表达，如血液中的CD36基因、肠道和血液中的StAR基因、闭壳肌中的GST基因以及血液和闭壳肌中均存在显著性差异的视黄素X受体基因。 2.基因结构分析：对SRB-like-3基因的基因组序列分析后发现,SRB-like-2和SRB-like-3基因是通过发生可变剪切事件产生的两种剪接体，它们的开放阅读框都含有10个外显子和9个内含子，在基因组中的大小分别为11.3kb和12.7kb；对SRB-like-2/3基因的启动子区域进行生物信息学分析后发现该区域至少有2个启动子，可基本确定该区域存在启动子，并在SRB-like-2/3基因的启动子区发现有280个转录因子结合位点，这些结果为构建验证实验的荧光素酶表达载体提供了一定的参考价值；对SRB-like2/3蛋白质的结构特征进行生物信息学分析后发现，它们都具有多个N-连接糖基化位点、酪蛋白激酶II磷酸化位点、豆蔻酰化位点、蛋白激酶C磷酸化位点及半胱氨酸残基等，表明这两种蛋白质可能具有相似的功能。 3.蛋白功能验证：通过Westernblot实验发现，在金色扇贝的肠道和性腺中，SRB-like-2蛋白表达量均高于SRB-like-3的蛋白表达量；类胡萝卜素结合实验证实了SRB-like-2/3的重组蛋白均具有结合叶黄素、玉米黄质的能力；通过免疫共沉淀实验获得了一些与SRB-like-3蛋白发生相互作用的蛋白质，如卵黄蛋白原蛋白、StAR-like-3蛋白及脂质相关蛋白等；对StAR-like-3基因进行RNA干扰后发现抑制该基因的表达能够显著降低金色扇贝血液中的类胡萝卜素含量，通过对其他与类胡萝卜素富集相关基因进行检测时发现，SRB-like-2和SRB-like-3可能与StAR-like-3具有一定的协同作用，而SRB-like-4和BCMO1/2则可能参与了类胡萝卜素在扇贝体内的代谢过程。 本研究首次采用三代测序与二代测序技术相结合的方法对贝类富集类胡萝卜素的分子机制进行了探讨；利用BAC文库和染色体步移法对SRB-like-3的基因结构及启动子进行了分析；通过类胡萝卜素结合实验验证了SRB-like-2和SRB-like-3蛋白均具有结合类胡萝卜素的能力；利用免疫共沉淀实验筛选了一批与SRB-like-3蛋白的互作蛋白，对StAR-like-3基因进行RNA干扰后发现抑制该基因的表达能够显著降低金色扇贝血液中的类胡萝卜素含量，同时发现SRB-like-2和SRB-like-3基因在金色扇贝富集类胡萝卜素的过程中与StAR-like-3基因间可能存在一定的协同作用。本研究的结果不但有助于从分子角度揭示华贵栉孔扇贝“南澳金贝”富集类胡萝卜素的机制，而且可以为培育华贵栉孔扇贝新品种提供理论指导。
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