摘要
背景：慢性肾脏病（Chronic kidney disease, CKD）及其导致的终末期肾病(End stage renal disease，ERSD)，已成为一个全球性的健康问题。CKD包括糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)常常合并有脂代谢紊乱，主要表现为高甘油三酯血症、高胆固醇血症。既往研究发现，高脂血症本身可导致肾脏损害，如系膜细胞增殖、肾小球硬化、肾小管间质纤维化等。足细胞是肾小球滤过屏障的重要组成部分，是高度分化的细胞，再生能力有限。足细胞损伤、脱落丢失和凋亡可导致蛋白尿和肾小球滤过功能障碍。在高脂血症早期即可发生足突融合、细胞骨架异常、细胞凋亡、脱落等，其机制可能与高脂环境下肾小球足细胞内脂质异常摄取、集聚过多有关。分子伴侣介导的自噬（Chaperone-mediated autophagy，CMA）是通过hsc70识别带KFERQ序列的蛋白质，并将其转运至溶酶体膜的表面与LAMP-2A这一特异性CMA蛋白受体相结合，使蛋白去折叠然后进入溶酶体腔内被溶酶体酶降解的过程。有研究发现脂滴(Lipid droplet，LD)表面存在PAT家族这一脂滴包被蛋白家族，包括perilipin1、perilipin2、perilipin3和perilipin5，对脂滴具有屏障保护作用，并参与了脂质的形成和降解。其中，perilipin 2 (PLIN2)在脂滴中有较高的表达，其表达水平与甘油三酯（Triglyceride，TG）含量和脂滴密度相关，被证明是脂滴的蛋白标志物。近来研究发现PLIN2也表达KFERQ序列，是CMA的底物蛋白。在脂肪肝的研究中发现，分子伴侣介导的自噬(CMA)可通过降解脂滴相关蛋白PLIN2调控肝脏的脂肪代谢。但CMA在DN患者血脂异常导致的肾小球足细胞中的确切作用尚不清楚。在此，我们利用体外模型研究CMA在棕榈酸(Palmitic acid，PA)诱导的足细胞脂质集聚和凋亡中的作用。 目的:探讨CMA是否通过降解PLIN2在棕榈酸诱导肾小球足细胞脂质集聚和凋亡中发挥重要作用。 方法：我们在没有使用或使用hsc70抑制剂VER155008、LAMP2 siRNA或CMA激活剂Torin1的情况下，用PA处理足细胞24h。然后采用油红染色、BODIPY脂质探针检测细胞内脂质含量，western blot、免疫荧光检测PLIN2的表达，免疫荧光共定位检测PLIN2和hsc70共定位、PLIN2与溶酶体共定位，流式细胞术检测足细胞凋亡。western blot检测凋亡相关蛋白 Cleaved-caspase3 和 CMA 相关蛋白如 hsc70 和LAMP-2A的表达。 结果: （1）与对照组相比，PA可诱导足细胞的PLIN2的表达增加，且呈浓度依赖性，同时脂质集聚也增加。 （2）与对照组相比，PA在一定浓度范围内诱导足细胞的LAMP2A、hsc70蛋白表达明显增加，PLIN2和hsc70的共定位，PLIN2和溶酶体共定位都增加。 （3）采用VER155008抑制hsc70或siRNA转染足细胞敲低LAMP2，PA诱导的足细胞内PLIN2表达增加，同时脂质集聚增加。 （4）采用CMA诱导剂Torin1增强CMA活性，PA诱导的足细胞内PLIN2的表达减少，同时脂质集聚减少。 （5） PA可增加足细胞的凋亡和Cleaved-caspase3蛋白的表达，且呈浓度依耐性。采用VER155008抑制hsc70或siRNA转染足细胞敲低 LAMP2 ，阻断 CMA ，可以增加 PA 诱导的足细胞凋亡和Cleaved-caspase3蛋白的表达增加。采用CMA诱导剂Torin1增强CMA活性，可以发现PA诱导的足细胞凋亡和Cleaved-caspase3蛋白的表达减少。 结论: （1）PA诱导足细胞脂质集聚并增加PLIN2表达。 （2）PA在一定浓度范围内可诱导足细胞CMA活性增加并参与PLIN2的降解。 （3）CMA可通过降解PLIN2从而改善PA诱导的足细胞脂质集聚和凋亡。
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