摘要
目的： 肺癌是目前发病率与死亡率的均居首位的恶性肿瘤，其中80％的肺癌为非小细胞肺癌，病理分型又以肺腺癌最为常见。尽管分子靶向治疗等精准治疗取得了长足的进步，以铂类为主的化疗依然是目前晚期肺腺癌临床一线治疗的基石。许多患者化疗效果不佳或者初治效果较好，但再次治疗却很难达到理想效果。肿瘤的化疗耐药是治疗失败的重要原因，但其具体原因仍不完全清楚。研究肺腺癌化疗耐药分子机制并探寻可行的调节靶点，已成为临床肺腺癌治疗中亟待解决的关键性课题。既往关于肿瘤耐药的研究都集中于肿瘤细胞自身。近年来，肿瘤微环境在肿瘤耐药中的角色越来越引起重视。肿瘤相关成纤维细胞(Cancer-associated fibroblasts，CAFs)是肿瘤微环境中最为丰富的细胞成份之一。CAF，特别是经临床治疗后的CAF，对肿瘤细胞的耐药影响至今仍不明确。本研究旨在研究肿瘤相关成纤维细胞对肺癌化疗耐药的调控作用。通过体外共培养模型、基因芯片筛选，及组织学验证等手段发现化疗后CAF可能通过旁分泌IL-11促进肺腺癌细胞化疗耐药。本研究从肿瘤微环境角度揭示肺腺癌新的耐药机制，同时也可能为临床逆转肺腺癌耐药提供新的靶点。 方法： 1.收集55例接受过以顺铂为主化疗的晚期肺腺癌患者组织标本，免疫组化法检测标本α-SMA的表达，以此鉴定肺腺癌组织中CAF的比例。利用统计学方法分析肺腺癌组织中CAF比例与临床病理参数和化疗后无疾病进展时间之间的关系。 2.从肺腺癌组织标本中分离CAF，光镜下观察其形态，免疫荧光和Western-blot检测α-SMA和E-cadherin的表达。 3.建立CAF与肺腺癌细胞间接共培养模型，并予顺铂处理CAF，利用MTT法检测CAF对肺腺癌细胞化疗敏感性的影响。 4.基因表达谱芯片筛选顺铂处理前后成纤维细胞差异表达基因，并利用荧光实时定量RT-PCR和ELISA验证芯片结果。 5.选定IL-11作为研究对象。构建IL-11过表达慢病毒载体，感染CAF并筛选稳定过表达IL-11细胞（命名为CAF-IL-11）。MTT法检测CAF-IL-11培养上清对肺腺癌细胞化疗敏感性的影响。 6.细胞水平检测不同化疗药物及放疗处理CAF中的IL-11蛋白表达情况。 7.细胞水平和临床组织标本检测IL-11的表达，确定肿瘤间质中IL-11主要来源于CAF。 8.利用不同浓度的重组人IL-11作用于肺腺癌细胞，MTT法检测rhIL11对人肺腺癌细胞化疗敏感性的影响。 9.免疫荧光检测肺腺癌细胞A549、H1975的IL-11受体IL-11Rα表达情况。免疫组化法检测临床组织标本中IL-11Rα的表达，利用统计学方法分析肺腺癌织中IL-11Rα比例与临床病理参数和PFS之间的关系。 10.构建IL-11Rα受体慢病毒干涉表达载体，感染A549、H1975肺腺癌细胞，抗生素筛选稳定感染细胞。利用rhIL-11作用于上述IL-11Rα下调的细胞，MTT法检测rhIL11对其化疗敏感性的影响。 11.利用rhIL-11作用于肺腺癌细胞后，同时予顺铂处理细胞。克隆形成实验，流式细胞术检测其对肺腺癌细胞克隆形成能力及其凋亡率的影响。 12.将IL-11过表达的CAF与肺腺癌细胞混合;IL-11Rα受体下调或敲除的肺腺癌细胞与CAF混合，并设置相应的对照，建立裸鼠皮下移植瘤模型。成瘤后，给予腹腔注射顺铂行抑瘤实验，观察并记录肿瘤生长曲线。治疗结束后取肿瘤组织，免疫组化检测肿瘤细胞α-SMA、IL-11Rα、PCNA表达情况和TUNEL法检测石蜡包埋的肿瘤组织切片中细胞凋亡率的变化。 13.利用rhIL-11和STAT3磷酸化抑制剂处理不同IL-11Rα受体表达水平的肺腺癌细胞，检测其对肺腺癌细胞克隆形成能力及凋亡率的影响;同时利用Western-blot检测STAT3表达和磷酸化水平及与耐药相关的调控基因及蛋白BCL-2、Survivin的变化。 结果： 1.α-SMA是检测肿瘤相关成纤维细胞的最广泛的分子标志物。根据α-SMA评分将患者分为CAF高比例者与CAF低比例者。生存分析发现55例肺腺癌组织样本中CAF高比例组者（28例）化疗后PFS明显短于CAF低比例者(27例)(log-rank test,p=0.003)。 2.光镜下观察CAF呈长梭形或纺锤状;免疫荧光和Western-blot检测发现CAF高表达α-SMA，而不表达E-cadherin。 3.共培养模型下，顺铂处理后的CAF上清能明显减轻顺铂对肺腺癌细胞A549、H1975的杀伤作用，提高细胞存活率。 4.基因芯片结果显示:在差异表达倍数≥3条件下，经顺铂作用后的成纤维细胞较对照组存在高表达的基因达34条。进一步分析所有分泌性细胞因子表达情况，其中IL-11在所有细胞因子中显著高表达，且随顺铂浓度提高表达增加，差异倍数高达12.23。荧光实时定量RT-PCR和ELISA亦验证了这一结果。 5.过表达IL-11的CAF培养上清能明显降低肺腺癌细胞对顺铂的敏感性，提高其存活率。在IL-11Rα下调的肺腺癌细胞中，IL-11并不能降低顺铂对肺腺癌细胞杀伤率。 6.多西他赛和紫杉醇可以促进CAF中IL-11表达轻度增高，但与药物作用浓度无明显相关性;吉西他滨、培美曲塞处理的CAF中IL-11的表达则并不上调。不同剂量的放射线对CAF中IL-11表达无明显影响。 7.顺铂处理后的肿瘤细胞IL-11mRNA未见明显变化。免疫荧光双标记结果显示化疗后肺腺癌组织中IL-11主要由CAF表达。 8.不同浓度的rhIL-11作用于肺腺癌细胞后，能明显减轻顺铂对肺腺癌细胞A549、H1975的杀伤作用，提高细胞存活率，且随着浓度的增加，作用增强。 9.细胞免疫荧光显示IL-11Rα广泛表达于肺腺癌细胞(A549、H1975)的胞膜、胞浆。免疫组化结果显示:IL-11Rα广泛表达于肺腺癌细胞胞膜、胞浆。进一步生存分析结果显示:55例肺腺癌组织样本中IL-11Rα高表达者(25例)化疗后PFS明显短于IL-11Rα低表达者(25例)(log-rank test,p=0.047)。 10.顺铂处理后的肺腺癌细胞克隆形成能力下降;rhIL-11可以促进肺腺癌细胞克隆形成;而IL-11Rα下调的细胞rhIL-11作用并不明显。rhIL-11能明显降低顺铂诱导的肺腺癌细胞凋亡率。IL-11Rα下调的细胞中，肺腺癌细胞的凋亡率明显上升。 11.在动物实验中，CAF中IL-11表达水平的上调可以促进裸鼠皮下移植瘤的生成，降低顺铂抑瘤作用;而IL-11Rα表达下调的肺腺癌细胞肿瘤生长速度则受到明显的抑制，对顺铂的抑瘤作用更敏感。 12.rhIL-11可以促进肺腺癌细胞STAT3磷酸化，促进肿瘤细胞的克隆形成和抑制其凋亡，而pSTAT3抑制剂则可减轻rhIL-11的作用。同时，pSTAT3过表达可以促进下游信号通路中BCL-2和Survivin的表达。 结论： 1.顺铂治疗后的肿瘤相关成纤维细胞可以促进肺腺癌细胞化疗耐药; 2.顺铂治疗后的肿瘤相关成纤维细胞通过上调IL-11并作用于肺腺癌细胞，抑制顺铂诱导的凋亡，促进其克隆形成，进而促进肺腺癌顺铂耐药; 3.IL-11作用于肺腺癌细胞受体IL-11Rα，激活STAT3信号通路，抑制肺腺癌细胞凋亡，最终导致肺腺癌顺铂耐药。
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