摘要
遗传性红细胞病包括由红细胞酶缺陷，血红蛋白病，红细胞膜组分异常等引起的以贫血为主要临床表现的遗传性疾病，是目前全球最常见的遗传性疾病之一。 在本研究中，我们收集了两个遗传性红细胞病的家系，并对这两个家系进行了分子遗传学研究，分析了相关致病基因并鉴定了致病突变。 第一部分 一个新的β珠蛋白基因簇大片段缺失导致δβ-地中海贫血 目的：β-地中海贫血主要以常染色体隐性遗传为主，其致病的分子基础是β-基因发生突变，导致β-珠蛋白合成减少，α-和β-珠蛋白链比例失衡，多余的α-珠蛋白沉积在红细胞膜上，造成了红细胞的损坏。由β-珠蛋白基因簇大片段缺失导致的β-地中海贫血比较罕见，在中国南方人群中出现频率较高的缺失主要是中国型缺失以及东南亚型HPFH。 本研究中，我们发现了一例重型β地中海贫血病人，该病人有一个来自父方的β地贫常见突变CD41-42(HBB：c.126_129del CTTT)，来自母方的是一个新的β-珠蛋白基因簇大片段缺失本文通过家系研究对这一β-珠蛋白基因簇大片段缺失进行分子鉴定，分析其对β-珠蛋白基因表达及其对患者表型的影响。 方法：1.研究对象：先证者是来自江西的一位3岁女性，从4个月大时开始出现严重的溶血性贫血，从6个月大时每个月输血2个单位，被诊断为重型地中海贫血，HBB基因测序显示基因型为βCD41-42/βCD41-42，但是先证者的父母中只有父亲基因型为CD41-42/βN。MLPA分析发现先证者及其母亲DNA样本中可检出一个大片段缺失。 2.实验方法：通过NGS捕获测序技术预测该缺失突变的断裂点区域，并根据Gap-PCR的原理和方法，在断裂点的两端设计特异性引物，PCR扩增出特异性产物进行Sanger测序鉴定大片段缺失的准确断裂点位置。 结果：先证者临床诊断为重型地中海贫血（Thalassemia Major，TM），分别遗传了父亲的CD41-42(HBB：c.126_129del CTTT)与母亲的大片段缺失。NGS预测该缺失突变长度约为222kb，通过Gap-PCR方式扩增出重组DNA特异性条带，对PCR产物进行Sanger测序验证了这个缺失范围为chr11：5031238-5254163(hg19)，缺失大小为222，920bp，断裂点区存在一个四个碱基(GTCT)的微同源序列。 结论：1.本研究报道了一个全新的β-珠蛋白基因簇大片段缺失β223kb del，丰富了地中海贫血的突变谱，可加深对中国人群地贫类型的认识。 2.MLPA与NGS技术结合，有助于提高罕见或者新发的拷贝数变异的检出率。 第二部分 一个遗传性球形红细胞增多症家系致病突变的鉴定 目的：遗传性球型红细胞增多症（Hereditary Spherocytosis，HS）是一种在世界范围内常见的遗传性红细胞膜疾病，临床表现为贫血，黄疸，脾肿大，在血涂片中可见球形红细胞，通过基因分析发现致病基因突变可以为临床诊断提供有力证据。 在本研究中，我们通过收集到一个遗传性球红的家系，并对其致病原因进行了分子遗传学研究，在ANK1基因上发现了一个移码突变(ANK1：c.2394_2397del CAGT)。 方法：1.研究对象：先证者是一位来自广东的6岁男性贫血患者，病因不明。检查发现先证者脾脏增大，先证者父亲因不明原因溶血在6岁时行脾全切术。我们在先证者及其父亲的外周血中发现球形红细胞。 2.研究方法：采集先证者及其家庭成员外周血，采用SDS-PAGE对红细胞膜蛋白成分进行分析。对锚蛋白ANK1基因进行Sanger测序查找致病突变。 结果：SDS-PAGE证实了HS的诊断并提示该病例的锚蛋白缺失。对先证者及其父亲的锚蛋白ANK1基因测序后发现，22号外显子存在四个碱基的缺失突变ANK1：c.2394_2397del CAGT。cDNA测序结果可见轻微套峰，突变后等位基因DNA序列一致，提示mRNA转录后被降解。 结论：1.我们确诊了一例HS患者并明确了致病突变位点ANK1：c.2394_2397del CAGT，同时通过cDNA测序发现突变后等位基因的mRNA在体内存在表达但表达量较低。 2.ANK1：c.2394_2397del CAGT导致锚蛋白表达量下降，是导致球形红细胞产生的主要原因。 3.本研究表明SDS-PAGE结合Sanger测序可以作为HS基因分析的一种手段。
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